小兒感冒顆粒HPLC指紋圖譜研究

任菲菲，鄭艷青，馬斐，張靜，劉德麗

(德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 德州 253015)

小兒感冒顆粒為小兒感冒常用藥，OTC乙類，由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍(lán)根、地黃、地骨皮、白薇、薄荷、石膏十味藥組成[1]，收載于《中國藥典》2015年版(一部)，藥典中對(duì)具體藥材配伍無明顯規(guī)定，原標(biāo)準(zhǔn)收載項(xiàng)目僅有性狀、檢查項(xiàng)和靛藍(lán)的薄層鑒別，且靛藍(lán)的鑒別沒有專屬性。因其處方較為復(fù)雜，單一成分的指標(biāo)不能控制其整體的工藝和質(zhì)量；而指紋圖譜具有多指標(biāo)全面分析的功能，已廣泛應(yīng)用于中藥材及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究[2-6]。因此本試驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法[7]，建立了小兒感冒顆指紋圖譜，可以更加系統(tǒng)地對(duì)小兒感冒顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制[8]。

1 儀器和試藥

Agilent-1260高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，Milli-Q Integral 超純水系統(tǒng)。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-201716，中國食品藥品檢定研究院)；木犀草苷對(duì)照品(批號(hào):111720-201609，中國食品藥品檢定研究院)；3,5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品(批號(hào):110821-201514，中國食品藥品檢定研究院)；連翹苷對(duì)照品(批號(hào):110821-201514，中國食品藥品檢定研究院)。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

31批小兒感冒顆粒樣品信息見表 1。

表1 樣品信息

表1(續(xù))

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Capcell PAK C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：0～45 min(327 nm)，45～83 min(202 nm)；進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：乙腈(A)和0.2%磷酸溶液(B)[9]，梯度洗脫條件為：0～20 min 8%～15%A；20～50 min 15%～20%A；50～60 min 20%A；60～73 min 20%～35%A；73～83 min 35%～70%A；流速：1.0 mL·min-1。

2.2 對(duì)照溶液的制備 取綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和連翹苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含 50 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL， 密塞，稱定重量，超聲處理功率(500 W，頻率 40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 精密度試驗(yàn)[10]取S18樣品按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次,各主要色譜峰的保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均<1.1%，表明儀器精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取S18樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定主要色譜峰面積。結(jié)果保留時(shí)間RSD均<1.5%，相對(duì)峰面積RSD均<4.5%，表明本方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S18樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫下，分別在 0、4、6、8、12、16、24 h進(jìn)樣，各主要色譜峰的保留時(shí)間RSD均<2.2%，相對(duì)峰面積RSD<5.0%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 小兒感冒指紋圖譜的建立

2.7.1 同一企業(yè)批間相似度 將3批來自JZ公司的小兒感冒顆粒按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將各批次樣品圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2012年版”(國家藥典委員會(huì))進(jìn)行比較，摒棄4 min之前的溶劑峰和82 min之后的沖柱峰，確定了36個(gè)共有峰，以第一批樣品為參照譜圖，采用中位法，時(shí)間寬度為0.10，生成了該廠家的對(duì)照譜圖(見圖1)[11-12]。

圖1 JZ公司小兒感冒顆粒指紋圖譜(從下到上：S2、S3、S4，R-JZ公司對(duì)照譜圖)

將11批ZZ公司、3批HN公司和3批WH公司的小兒感冒顆粒分別按上述方法操作，分別確定了46個(gè)、32個(gè)和33個(gè)共有峰，并分別生成了廠家的對(duì)照譜圖(見圖2～4)。因部分廠家僅有一批或兩批樣品，沒有代表性，故不研究其批間相似度。

圖2 HN公司小兒感冒顆粒指紋圖譜(從下到上：S14、S15、S16，R-HN公司對(duì)照譜圖)

結(jié)果顯示，除HN廠家的1批外，其余同一廠家不同批號(hào)之間的相似度均在0.86以上，結(jié)果見表2。

圖4 WH公司小兒感冒顆粒指紋圖譜(從下到上：S29、S30、S31，R-WH公司對(duì)照譜圖)

2.7.2 不同企業(yè)批間相似度 將31批來自11個(gè)不同企業(yè)的小兒感冒顆粒按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將各批次樣品圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2012年版”(國家藥典委員會(huì))進(jìn)行比較，確定了29個(gè)共有峰，校正后的保留時(shí)間分別為：5.459、5.739、8.22、8.791、9.497、10.093、15.816、16.954、22.763、24.328、33.035、37.277、38.12、40.276、45.265、46.445、47.831、49.812、51.195、56.187、58.763、69.394、72.16、73.696、74.641、76.141、76.978、78.623、81.132 min。

以S18樣品為參照譜圖，采用中位法，時(shí)間寬度為0.10，生成了小兒感冒顆粒的對(duì)照譜圖(見圖5～6)。并計(jì)算不同批次小兒感冒顆粒之間的相似度。結(jié)果表明，31批小兒感冒顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度結(jié)果在0.798～0.994之間(見表3)。

表3 31批小兒感冒顆粒指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)表

圖5 小兒感冒顆粒參照譜圖

圖6 31批小兒感冒顆粒指紋圖譜比較(從下到上：S1～S31，R-小兒感冒顆粒參照?qǐng)D譜)

2.8 共有峰的確定 分別精密吸取綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷⑦B翹苷對(duì)照品溶液及供試品溶液，注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，采集色譜圖，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定位并結(jié)合DAD光譜，確定7 號(hào)峰、14 號(hào)峰、18號(hào)峰、22號(hào)峰分別為綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩岷瓦B翹苷(見圖7～11)。

圖7 樣品色譜圖

2.9 系統(tǒng)聚類分析 將 29個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SPSS 19.0軟件，聚類法采用組間均聯(lián)法，選用夾角余弦為刻度[13]，上述30個(gè)樣品聚類分析結(jié)果見圖12。聚類分析將30個(gè)樣品分為3類，其中11、13號(hào)為第一類；10為第二類，其他均為第三類 。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇 供試品溶液中綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸在327 nm[14]波長下有很好的響應(yīng)，而連翹苷在202 nm[15]波長下有較好的相應(yīng)，所以選擇雙波長切換的方法，在此波長條件下，可以更加全面的比較各企業(yè)間的投料區(qū)別。

圖8 綠原酸

圖9 木犀草苷

圖10 3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸

圖11 連翹苷

圖12 小兒感冒顆粒聚類分析樹狀圖

3.2 流動(dòng)相的選擇 該試驗(yàn)先后考察了甲醇-0.2%磷酸和乙腈-0.2%磷酸[16]不同的流動(dòng)相，結(jié)果顯示乙腈-0.2%磷酸體系下樣品響應(yīng)值較強(qiáng)，通過反復(fù)試驗(yàn)確定了洗脫比例，在該洗脫比例下各個(gè)峰均能得到很好的分離。

3.3 同企業(yè)不同批次樣品相似度分析 HN公司有S13樣品相似度為0.782，經(jīng)分析此批樣品為2017年生產(chǎn)，其余兩批為2018年生產(chǎn)，提示該企業(yè)2017年、2018年在原材料的購買、工藝的提取等方面有一定的調(diào)整；ZZ公司除S20樣品相似度為0.867，其余樣品相似度均在0.946以上，研究樣品批次可以看出S20為2017年10月份生產(chǎn)，提示10月份生產(chǎn)的樣品原料和工藝可能有一定的問題，有待進(jìn)一步的考察。

3.4 不同企業(yè)樣品相似度分析 ZZ公司的樣品確定了46個(gè)共有峰，綠原酸、木犀草苷、連翹苷峰面積普遍高于其他企業(yè)，提示該公司在原料的選擇和工藝的流程設(shè)計(jì)有明顯的優(yōu)勢(shì)，GX公司編號(hào)為S6的樣品相似度為0.786，提示為異常樣品，但因只有一批樣品，無法分析其具體原因，仍需進(jìn)一步考察。

本試驗(yàn)建立了31批次小兒感冒顆粒的指紋圖譜并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，為質(zhì)量監(jiān)督管理部分評(píng)價(jià)小兒感冒顆粒的質(zhì)量提供了基本數(shù)據(jù)，并為小兒感冒顆粒的質(zhì)量控制提供了新的思路。