靶向性超順磁性氧化鐵納米顆粒早期診斷胰腺癌的研究進(jìn)展

譚廣，李卉

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院放射科，上海 200233)

胰腺癌起病隱匿，且具有高侵襲性，在早期無癥狀時(shí)即可呈浸潤性生長，其年死亡率與發(fā)病率相當(dāng)，5年生存率僅為5%[1-2]。雖然放化療可改善胰腺癌患者5年生存率，但治療效果有限，在殺傷胰腺癌的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，化療藥物耐藥性的產(chǎn)生也較明顯[3]。目前胰腺癌治療仍首選手術(shù)治療，術(shù)后患者5年生存率提高[4]。但大多數(shù)患者診斷胰腺癌時(shí)已失去手術(shù)指征，預(yù)后往往較差。鑒于胰腺癌早期轉(zhuǎn)移的特性以及目前治療手段的局限性，實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早期診斷對疾病的治療及預(yù)后至關(guān)重要。臨床工作中，磁共振成像的應(yīng)用已較為普遍，其圖像解剖分辨率高，結(jié)合磁共振造影劑，可大幅度提高組織間對比度。其中，超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)進(jìn)入體內(nèi)后能夠縮短橫向弛豫時(shí)間(T2值)，使強(qiáng)化的組織在T2加權(quán)圖像上表現(xiàn)為低信號(hào)[5]。近年來，研究人員通過基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法發(fā)現(xiàn)，胰腺癌具有一系列特異性高表達(dá)分子，可作為胰腺癌的生物學(xué)靶標(biāo)[6]。SPIO生物兼容性、生物可降解性好，生物毒性低[7]，且SPIO具有豐富的表面活性基團(tuán)，易于對其進(jìn)行表面化學(xué)修飾，若在SPIO表面連接相應(yīng)配體，便可主動(dòng)靶向于腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)胰腺癌的靶向性診斷?，F(xiàn)就主動(dòng)靶向性SPIO用于胰腺癌早期診斷的研究進(jìn)展予以綜述。

1 制備方法

SPIO的制備方法有多種，主要包括化學(xué)共沉淀法、高溫?zé)峤夥ā⑺疅岱?、微乳液法等[8]。直接合成的SPIO由于磁性吸引和范德華力容易沉淀聚集，易被人體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬[9]，故需要對SPIO進(jìn)行表面修飾以提高其穩(wěn)定性和分散性。聚乙二醇是最常用的表面修飾劑，能夠提高SPIO的穩(wěn)定性及水溶性，減少與血漿蛋白的交聯(lián)，從而減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)單核/巨噬細(xì)胞對SPIO的攝取，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間[10]；且可以通過聚乙二醇連接其他基團(tuán)(如-NH2、-COOH、-CHO、-OH及-SH)進(jìn)行更多的表面化學(xué)修飾，從而延伸出一系列具有特定功能的造影劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。這也是SPIO實(shí)現(xiàn)生物利用和主動(dòng)靶向的基礎(chǔ)。旋糖苷是另一種較常見的表面修飾劑[11]。

化學(xué)共沉淀法合成的SPIO較易發(fā)生團(tuán)聚，分散性和結(jié)晶度相對較差，樣品雜質(zhì)含量也較多，但由于操作步驟相對簡單，對實(shí)驗(yàn)條件要求不高，成本也相對較低，故目前仍是SPIO最常用的制備方法。其他3種方法可以制備出分散性和結(jié)晶度較好的SPIO，但生產(chǎn)成本或設(shè)備要求較高。因此，以上4種SPIO的合成方法各有利弊，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)需要及技術(shù)條件等綜合考慮。

2 原 理

氧化鐵是磁性納米材料中最主要的組成部分，主要包括Fe3O4和Fe2O3[12]。由于鐵原子不成對的核外電子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生凈磁化向量，因此具有很強(qiáng)的順磁性。磁性顆粒在室溫下具有磁記憶，但因SPIO直徑在納米級范圍內(nèi)，故其失去了磁記憶而成為超順磁性物質(zhì)[13]；在組織中，由于強(qiáng)磁矩的作用，SPIO周圍磁場的均勻性發(fā)生了改變，當(dāng)水分子彌散穿過不均勻磁場時(shí)造成自旋失相位和橫向弛豫加速，縮短了T2時(shí)間[14]。SPIO的影響效應(yīng)在T2加權(quán)成像圖像上表現(xiàn)為低信號(hào)，因此SPIO也被稱為陰性對比劑。

3 主動(dòng)靶向性SPIO的優(yōu)勢

被動(dòng)靶向，即高通透性和滯留效應(yīng)，主要由于腫瘤組織的脈管系統(tǒng)破損，滲漏增加且缺少有效的淋巴回流，因此納米顆粒能夠經(jīng)過血流被動(dòng)富集于腫瘤部位，相較于正常組織，腫瘤部位納米顆粒濃度升高。而連有靶向配體的納米顆粒，借助配體與靶細(xì)胞表面過表達(dá)受體之間的高度親和力，選擇性地輸送至特定部位，從而實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向。與被動(dòng)靶向相比，主動(dòng)靶向通過納米顆粒的特異靶向性，可以進(jìn)一步提高特定部位的納米顆粒濃度，并減少其在非腫瘤部位的蓄積以及降低對正常組織的傷害，從而增加腫瘤部位與其他部位的成像對比度，有利于疾病的診斷，具有明顯優(yōu)勢。基于不同生物學(xué)靶標(biāo)，靶向配體可為單克隆抗體、抗體片段、重組蛋白及多肽等。文獻(xiàn)報(bào)道，SPIO結(jié)合特異性靶向配體，可以實(shí)現(xiàn)胰腺癌的早期診斷，有利于疾病的及時(shí)干預(yù)[15]。

4 胰腺癌靶向性SPIO

目前，用于胰腺癌最常用的血清腫瘤標(biāo)志物為糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)，但并不是所有胰腺癌患者均高表達(dá)CA19-9，其他胃腸道癌癥患者中也可異常高表達(dá)CA19-9，因此CA19-9診斷胰腺癌的敏感性和特異性欠佳。此外，CA19-9也不能提供原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶病變部位的相關(guān)信息[16]。可見，用于胰腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)在腫瘤部位異常高表達(dá)，而在正?；蚱渌∽兘M織內(nèi)低表達(dá)甚至不表達(dá)，并具有一定的敏感性和特異性。

4.1尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)及其受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR) uPA是一種絲氨酸蛋白酶，與uPAR相互作用后可參與調(diào)節(jié)腫瘤基質(zhì)的降解、癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成等多種腫瘤行為[17]。可見，uPA與uPAR相互作用可增加腫瘤的惡性程度，若采用uPA類似物競爭結(jié)合uPAR，也許可以改善腫瘤患者預(yù)后。研究表明，在超過86%的胰腺癌組織中，腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均異常高表達(dá)uPAR，而uPAR在正常胰腺及慢性胰腺炎組織中幾乎不表達(dá)[18]。因此，uPAR能作為胰腺癌診斷或治療相關(guān)研究中較好的細(xì)胞表面受體。

胰腺癌是乏血供腫瘤，間質(zhì)成分相對較多。研究表明，腫瘤間質(zhì)的形成與胰腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥性的產(chǎn)生有很大關(guān)系[19-20]，這也是胰腺癌惡性程度高的另一個(gè)原因。同時(shí)，腫瘤間質(zhì)較多也限制了化療藥物有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)[21]。鑒于此特點(diǎn)，Yang等[22]在氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticle，IONP)表面連接uPAR特異性結(jié)合配體的N端片段(N-terminal fragment，ATF)和近紅外熒光分子Cy5.5構(gòu)建Cy5.5-ATF-IONP發(fā)現(xiàn)，其可以有效實(shí)現(xiàn)對胰腺癌主動(dòng)靶向的磁共振與熒光雙模態(tài)成像，對小鼠原位胰腺癌甚至是轉(zhuǎn)移灶均能很好地顯影。另有研究在SPIO表面連接uPAR特異性結(jié)合配體ATF，并通過溶酶體底物肽鏈連接化療藥物吉西他濱(gemcitabine，Gem)構(gòu)建了ATF-IONP-Gem[23]。結(jié)果顯示，在ATF的主動(dòng)靶向及受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用下，ATF-IONP-Gem進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酶切作用下，底物肽鏈被切斷，Gem釋放出來，從而可以有效抑制腫瘤的生長，且IONP作為造影劑，可以進(jìn)行磁共振顯像，實(shí)現(xiàn)胰腺癌的主動(dòng)靶向成像和精準(zhǔn)治療。因此，uPAR能夠作為胰腺癌較好的靶點(diǎn)，在某種程度上可能減輕胰腺癌乏血供引起的探針灌注不足。

4.2胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)及其受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) IGF1R是一種跨膜的酪氨酸激酶活性受體，結(jié)構(gòu)與胰島素類似，可被IGF1啟動(dòng)[24]。IGF1R與配體結(jié)合，可啟動(dòng)自磷酸化和一系列下游級聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，繼而促進(jìn)細(xì)胞生長。研究表明，IGF1R在多種腫瘤中高表達(dá)，并可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡等方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[25]。

與uPAR類似，IGF1R在40%～90%的胰腺癌及其腫瘤基質(zhì)中高表達(dá)[26]，而在正常胰腺組織中低表達(dá)[27]。Zhou等[28]在IONP表面連接有近紅外熒光染料NIR830標(biāo)記的IGF1抗體，并通過IONP表面的兩親性聚合物包裹化療藥物多柔比星(doxorubicin，Dox)構(gòu)建了IGF1-IONP-Dox。由于胰腺癌細(xì)胞來源移植的動(dòng)物模型在組織和病理學(xué)特征上與人胰腺癌有很大差異，因此不能有效預(yù)測探針的實(shí)際應(yīng)用效果。有研究構(gòu)建了病人來源移植(patient-derived xenograft，PDX)的動(dòng)物模型，將手術(shù)切除的人胰腺癌組織小塊種植于小鼠胰腺，發(fā)現(xiàn)小鼠瘤塊的異質(zhì)性及間質(zhì)組成成分等均與人胰腺癌相似[29]，可見該模型可以很好地維持腫瘤移植物的多種組織學(xué)特性。將IGF1-IONP-Dox注入PDX模型小鼠體內(nèi)，可以主動(dòng)靶向腫瘤部位，并通過標(biāo)記抗體的NIR830熒光顯像，進(jìn)一步證明了IGF1-IONP-Dox的良好靶向性。與無靶向性的IONP-Dox和游離Dox相比，在腫瘤部位的弱酸性微環(huán)境下，IGF1-IONP-Dox釋放的Dox可以更有效地抑制腫瘤生長，驗(yàn)證了靶向性給藥的可行性[28]。該研究的創(chuàng)新之處為采用PDX動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且IGF1-IONP-Dox實(shí)現(xiàn)了磁共振與熒光雙模態(tài)成像，以及成像與藥物治療的聯(lián)合應(yīng)用，其中Dox通過腫瘤部位的pH響應(yīng)進(jìn)行釋放，而Yang等[22]構(gòu)建的ATF-IONP-Gem通過酶響應(yīng)性釋放藥物，為研究靶向性藥物的傳遞提供了不同方案。

4.3整合素αvβ3整合素蛋白是一類細(xì)胞黏附受體家族蛋白，是由α和β兩個(gè)亞基通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成的異二聚體跨膜糖蛋白[30]。該家族共有24個(gè)成員，其中整合素αvβ3與多種癌癥有關(guān)，是目前研究最多的家族成員。研究表明，整合素αvβ3在正常血管和其他正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)，并保持休眠狀態(tài)，但在多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中卻顯著上調(diào)[31]。有文獻(xiàn)報(bào)道，整合素αvβ3過表達(dá)極大地驅(qū)推動(dòng)了腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[32]。

整合素αvβ3可以特異性結(jié)合線性、環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽及含RGD三肽序列的多肽[33]。目前有研究表明，iRGD(CRGDK/RGPD/EC)這一細(xì)胞穿膜肽，不僅能主動(dòng)靶向于αvβ3，還能增加腫瘤細(xì)胞的通透性，更有利于多肽本身或攜帶其他物質(zhì)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，因此iRGD為腫瘤的主動(dòng)靶向性成像或治療提供了新方向[34]。Zuo等[35]構(gòu)建了不同合成比例的iRGD-SPIO，與胰腺癌細(xì)胞共同孵育后進(jìn)行T2加權(quán)成像，結(jié)果證明當(dāng)SPIO比例不變時(shí)，隨著iRGD比例的增加，T2信號(hào)逐漸降低，說明在iRGD的靶向作用下，SPIO更有利于聚集在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)；相較于游離SPIO，普魯士藍(lán)染色試驗(yàn)也證明了iRGD-SPIO可以更好地靶向胰腺癌細(xì)胞，但該實(shí)驗(yàn)未能在活體水平進(jìn)一步驗(yàn)證。由于αvβ3在多種腫瘤中均異常高表達(dá)，因此有研究將RGD與SPIO聯(lián)合應(yīng)用，用于結(jié)腸腺癌[36]、惡性膠質(zhì)瘤[37]和卡波西肉瘤[37]等疾病的診斷。

4.4去糖基化黏蛋白-1(mucin-1,MUC-1) MUC-1是由兩個(gè)亞基組成的跨膜糖蛋白，在大多數(shù)上皮來源的腫瘤(胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等)內(nèi)均異常高表達(dá)，且MUC-1在腫瘤細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)均存在，分布范圍較廣[38]。在正常組織中，MUC-1高度糖基化，而在癌組織中去糖基化[39]，這一特征也使區(qū)分正常組織與癌組織成為可能。

Medarova等[40]在交聯(lián)氧化鐵納米顆粒(crosslinked superparamagnetic iron oxide nanoparticles，CLIO)表面修飾近紅外熒光分子Cy5.5，并結(jié)合去糖基化MUC-1的特異性肽鏈EPPT構(gòu)建了CLIO-EPPT，用于胰腺癌的主動(dòng)靶向性雙模態(tài)成像，同時(shí)通過治療前后雙模態(tài)成像觀察瘤塊的大小變化，用于評估胰腺癌對于化療藥物5-氟尿嘧啶的治療反應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷和治療的追蹤與隨訪。由于去糖基化 MUC-1在多種腫瘤中均異常高表達(dá)，因此推測CLIO-EPPT也可用于其他腫瘤的早期診斷。

4.5其他相關(guān)受體 研究表明，表皮生長因子受體(epidermal growth factor recepter，EGFR)[41]、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)[42]以及網(wǎng)格蛋白-1[43]在絕大多數(shù)胰腺癌中均異常高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，抗EGFR的單鏈抗體(ScFvEGFR)通過化學(xué)鍵連接在量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)和氧化鐵(iron oxide，IO)納米顆粒表面，構(gòu)建的ScFvEGFR-QDs和ScFvEGFR-IO均可以特異性主動(dòng)靶向原位胰腺癌，說明了靶向配體在探針構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用[44]；He等[45]將CXCR4單克隆抗體連接在超小超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)納米顆粒表面，構(gòu)建了CXCR4-USPIO，研究探針的主動(dòng)靶向性磁共振成像，以及利用磁共振T2強(qiáng)化率和ΔR2值半定量分析CXCR4的表達(dá)水平，為探針在細(xì)胞生物水平的應(yīng)用提供了新思路；Chen等[46]構(gòu)建的Plectin-SPION-Cy7以及Wang等[47]構(gòu)建的dyeBSA SPION-mAb，用于胰腺癌的網(wǎng)格蛋白-1依賴性主動(dòng)靶向以及磁共振與熒光聯(lián)合成像，進(jìn)一步證明雙模態(tài)成像的優(yōu)勢。

5 小 結(jié)

胰腺癌的早期診斷與及時(shí)干預(yù)治療一直是臨床醫(yī)師面臨的一大難題，有限的治療選擇以及治療效果不理想決定了實(shí)現(xiàn)胰腺癌早期診斷的重要性。分子影像學(xué)的出現(xiàn)使胰腺癌的早期診斷成為可能。研究表明，胰腺癌具有一系列高表達(dá)腫瘤標(biāo)志物，而在正常胰腺或胰腺炎中幾乎不表達(dá)，利用這些腫瘤標(biāo)志物就可以區(qū)分胰腺癌與其他胰腺疾病，這為胰腺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提供可能[48]。SPIO良好的生物學(xué)特性以及易于表面化學(xué)修飾的特征使其在磁共振成像相關(guān)分子影像研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，若結(jié)合特異性腫瘤標(biāo)志物，就可實(shí)現(xiàn)探針對于腫瘤的主動(dòng)靶向；或結(jié)合熒光分子或化療藥物等，實(shí)現(xiàn)腫瘤的磁共振與熒光雙模態(tài)成像或者靶向性治療，從而可大大提高疾病的診斷率或治療效果。目前已有結(jié)合不同腫瘤標(biāo)志物的SPIO用于胰腺癌的早期診斷或靶向治療的相關(guān)研究，并已取得一些成果。未來，分子影像用于胰腺癌的早期診治將為精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施提供新方向。