尿源性干細胞在再生醫(yī)學的應用及研究現(xiàn)狀

宋強，張紅，王欽，朱成

(1.成都醫(yī)學院，成都 610500； 2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院急診科，成都 610500)

干細胞具有發(fā)育全能性或多能性，可以誘導分化為多種細胞類型，目前許多學者對體干細胞、骨髓來源干細胞和脂肪來源干細胞進行了長期研究，并應用于組織工程和再生醫(yī)學[1-2]。但間充質(zhì)干細胞來源有限，目前臨床廣泛使用的供體來源細胞(如角質(zhì)形成細胞、脂肪干細胞)樣品可從血液、臍帶血管、胚胎、皮膚和毛發(fā)中通過針插入刮擦、活檢等有創(chuàng)操作獲取，雖然這些細胞可以通過多種方案培養(yǎng)和分化，但樣品分離復雜，細胞也需要較長時間擴增，因此尋找一種良好的種子細胞對組織工程及再生醫(yī)學的發(fā)展具有重要意義。

Sutherland和Bain[3]從新生兒尿液中培養(yǎng)出具有有限增殖潛力的脫落細胞群。Zhang等[4]在培養(yǎng)無菌尿液時培育出3種不同形態(tài)的細胞，分別為完全分化的上皮細胞、分化的尿路上皮來源、肌肉來源、內(nèi)皮來源的間質(zhì)細胞和未分化的祖細胞，并將具有紡錘體外觀的祖細胞分離，即為尿源性干細胞(urinary stem cells，USCs)。隨后有學者證實尿液中可以培養(yǎng)出USCs，且膀胱腫瘤患者尿液中亦可分離培養(yǎng)出USCs[5]。由于USCs的腎臟皮質(zhì)標志物的高表達來源于腎臟，若接受男性腎移植的女性患者中存在“Y染色體”，則表示USCs可能來源于腎臟[6-7]。USCs作為成體干細胞，可誘導分化為尿路上皮細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞及心肌細胞，并可重編程為疾病特異性誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)的原始細胞[8-11]?，F(xiàn)就USCs在成體干細胞生物學特性及醫(yī)學實驗中的應用予以綜述。

1 USCs生物學特性

USCs為短梭形“米粒樣”外觀，細胞生長曲線呈“S”形[4]。USCs在細胞增殖期間未出現(xiàn)變異及重組現(xiàn)象，但隨著USCs傳代代數(shù)的增加，部分表面標志物也會發(fā)生改變[6,12-13]。Lang等[14]發(fā)現(xiàn)，隨著供體年齡的增長及尿液儲存時間的延長，USCs的活力及增殖潛力可能降低。Bharadwaj等[6]進一步研究確定了USCs的生物學特性，USCs能夠表達間充質(zhì)干細胞標志物(CD29、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105)、外周細胞標志物(CD146)、某些不穩(wěn)定細胞的表達干細胞標志物(SOX2，Oct3/4、SSEA-4)，而不表達造血干細胞標志物CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、CD133等。此外，每個標志物的表達水平在成體干細胞的傳代培養(yǎng)過程中可發(fā)生變化[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，USCs較其他廣泛使用的干細胞(如骨髓干細胞、血液祖細胞、角質(zhì)形成細胞祖細胞、臍帶干細胞或脂肪來源干細胞)的擴展性更高[16-18]。

USCs的生長依賴于供體的年齡[14]。Gao等[19]通過研究供體年齡對USCs的影響發(fā)現(xiàn)，幼兒(非嬰兒)尿液中分離的USCs具有更好的增殖和分化能力，揭示了“供體年齡越大，細胞衰老越多”的現(xiàn)象，表明青年人USCs更有活力，可以在短時間內(nèi)獲得更多USCs，從而用于基礎研究和臨床。間充質(zhì)細胞移植后可產(chǎn)生輕微免疫反應，是理想的治療細胞來源，但與同種異體血細胞混合時，USCs免疫反應更弱，說明USCs具有更好的免疫耐受性[20]。

2 USCs在醫(yī)學實驗研究中的應用

2.1USCs在泌尿生殖系統(tǒng)重建實驗研究中的應用

USCs在泌尿生殖系統(tǒng)中主要應用于修復創(chuàng)傷、感染、腫瘤、畸形等原因引起的泌尿系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常和功能障礙。USCs在體外經(jīng)過特殊培養(yǎng)基誘導，可轉(zhuǎn)化為功能性尿路上皮細胞和平滑肌細胞，研究中將分化的USCs聯(lián)合細菌纖維素支架移植入裸鼠體內(nèi)時，可形成尿路上皮和平滑肌組織[13]。Lee等[21]采用USCs和聚己內(nèi)酯表面修飾復合支架應用于膀胱重建，在糾正壓力性尿失禁的細胞治療策略的研究中發(fā)現(xiàn)，USCs可通過表達血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促進肌肉和神經(jīng)再生，且過表達VEGF的USCs可以提高移植細胞的存活率，促進肌源性分化，改善神經(jīng)支配[22]。在神經(jīng)損傷引起勃起功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)，海綿體內(nèi)注射色素上皮衍生因子進行遺傳修飾的USCs能夠促進勃起功能恢復和維持損壞海綿體的結(jié)構(gòu)[23]。對人工腎的研究發(fā)現(xiàn)，USCs也可以作為生物人工腎上皮和近端小管細胞的良好替代物，與生長因子結(jié)合并通過生物聚合物遞送時，USCs可釋放相似細胞因子(胰島素樣生長因子和VEGF)并增加血管形成，可見，USCs治療腎臟疾病的應用前景廣闊[22-23]。但由于腎臟是由26個異質(zhì)組織組成的復雜器官，因此分化的USCs能否保持與腎臟相似的功能仍需廣泛研究。

2.2USCs在皮膚修復重建實驗研究中的應用 USCs聯(lián)合聚己酸內(nèi)酯/凝膠納米纖維支架使用可以顯著促進兔受損全層皮膚愈合。此外，USCs還可以通過釋放細胞因子(VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β1)提升內(nèi)皮細胞增殖、遷移和成血管能力[24]。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，生物玻璃激活USCs的生長因子表達上調(diào)，且刺激USCs和受體細胞在傷口愈合中的旁分泌作用可促進內(nèi)皮細胞的毛細血管樣網(wǎng)絡形成、促進基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生以及成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，與未經(jīng)任何處理的USCs相比，通過改善傷口部位的血管生成和膠原沉積，生物玻璃激活的USCs能夠展現(xiàn)出更好的傷口修復能力。

2.3USCs在骨修復重建實驗中的應用 成骨細胞移植物可用作骨再生的有效解決方案，可分化為大量成骨細胞的自體細胞來源對于人骨移植至關(guān)重要[26-27]。Zhang等[25]和Guan等[28]發(fā)現(xiàn)某些特定基因、試劑和細胞材料支架可促進USCs轉(zhuǎn)化為成骨細胞，硅酸鹽生物陶瓷顆粒/聚乳酸-羥基乙酸共聚物復合支架可以刺激USCs分化為成骨細胞，其作用機制可能是硅酸鈣加快了USCs增殖，使與成骨有關(guān)的基因和蛋白的表達增加，提高了堿性磷酸酶的活性，進而促進了鈣沉積，此外萬古霉素(Wnt/β聯(lián)蛋白信號抑制劑)能降低硅酸鹽生物陶瓷顆粒提取物對USCs成骨分化的刺激，說明硅酸鹽生物陶瓷顆粒提取物誘導的USCs的成骨分化可能涉及Wnt/β聯(lián)蛋白蛋白信號通路[28]。銀離子是臨床上一種常用抗菌劑，Qin等[29]在研究納米銀顆粒對USCs細胞毒性和成骨分化的影響中發(fā)現(xiàn)，納米銀顆?？梢源龠MUSCs成骨相關(guān)基因蛋白表達，當納米銀顆粒水平>4 mg/L時，呈濃度依賴性毒性，但納米銀顆粒水平合適時，可以促進USCs的成骨分化，但目前USCs聯(lián)合納米銀顆粒的修復機制尚不明確。

2.4USCs在骨骼肌實驗中的應用 Chen等[30]使用骨骼肌培養(yǎng)基誘導分化培養(yǎng)USCs的體外和裸鼠體內(nèi)實驗均顯示，米粒樣USCs在肌原性分化時被轉(zhuǎn)分化為紡錘形骨骼肌細胞，且能夠穩(wěn)定表達骨骼肌相應標志物(如結(jié)蛋白、myf5、myod、肌球蛋白和肌間線蛋白)，并且可在針對MyoD染色的50%～60%細胞中觀察到肌管樣結(jié)構(gòu)的形成。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)使用含有放射性物質(zhì)標記的生長因子的海藻酸鹽微球注射到裸鼠中，USCs能表達出更多的肌源性和內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄物和標志物。治療壓力性尿失禁時，尿道外括約肌由骨骼肌組成并受軀體神經(jīng)系統(tǒng)控制，使用微珠負載的生長因子和USCs治療時，USCs有效地產(chǎn)生了骨骼肌或內(nèi)皮細胞系，并且通過微珠載體釋放的生長因子促進骨骼肌和神經(jīng)生長[9]。在杜氏肌營養(yǎng)不良癥的藥物篩選和功能性遺傳研究中發(fā)現(xiàn)，天然USCs能表達全長肌營養(yǎng)不良蛋白轉(zhuǎn)錄物，經(jīng)過肌原性轉(zhuǎn)化后的細胞可能是研究肌營養(yǎng)不良蛋白基因的良好肌原性模型。此外，在肌營養(yǎng)不良癥治療中，USCs移植分化的肌肉細胞較目前的移植更有效。與iPSC和胚胎干細胞相比，USCs不僅能夠存活，適度增殖，還可產(chǎn)生更多的分化細胞，因此USCs可能是骨骼肌再生細胞的潛在來源[6]。

2.5USCs在血管及神經(jīng)再生實驗中的應用 過表達VEGF的USCs能增加血管生成、細胞存活、細胞生長、提高移植細胞的存活率，對植入細胞向肌細胞轉(zhuǎn)化以及植入后的神經(jīng)支配具有促進作用[9,22]。Liu等[31]使用內(nèi)皮分化培養(yǎng)基誘導USCs發(fā)現(xiàn)，誘導的USCs在體外和體內(nèi)表達水平更高的內(nèi)皮細胞特異性標志物(如CD31、血管性假血友病因子、一氧化氮合酶)，在裸鼠體內(nèi)形成復雜的管狀網(wǎng)絡并呈現(xiàn)出類似血管的緊密連接、遷移和侵襲能力以及產(chǎn)生一氧化氮的能力。此外，如果通過小鼠中的水凝膠、膠原蛋白、藻酸鹽微珠或三維生物膜遞送，USCs可以改善體內(nèi)血管形成和生長[32-34]。Guan等[12]將USCs接種到水凝膠支架并移植到大鼠腦皮質(zhì)區(qū)，結(jié)果顯示USCs能夠在病變部位存活，并表達與神經(jīng)表型相關(guān)蛋白質(zhì)神經(jīng)上皮干細胞蛋白、β-Ⅲ微管蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白，通過慢病毒轉(zhuǎn)染標記USCs，檢測到受損部位存在由USCs分化的神經(jīng)類似細胞，同時在大腦海馬等部位也檢測到分化的類神經(jīng)細胞，證明USCs具有遷移能力。Kim等[35]使用含有層粘連蛋白和血小板衍生生長因子BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基培養(yǎng)USCs、層粘連蛋白和PDGF-BB分別促進USCs的神經(jīng)元分化、層粘連蛋白和PDGF-BB的組合對USCs的神經(jīng)元分化顯示出協(xié)同效應。

2.6USCs在心臟疾病治療中的應用 心力衰竭引起心肌損傷，導致心臟功能異常，經(jīng)過介入等臨床治療，心力衰竭病死率和發(fā)病率仍然很高[36]。目前iPSC產(chǎn)生在心肌細胞樣譜系中的研究已經(jīng)取得許多進展，但人iPSC向功能性心肌細胞的分化仍未實現(xiàn)[37-38]。USCs可以通過細胞重編程分化為成熟功能性心肌細胞，并表達心臟特異性標志物(肌鈣蛋白T，α-肌動蛋白等)，為了進一步研究USCs產(chǎn)生的心肌細胞是否具有電學特性，Jiang等[39]使用自發(fā)搏動細胞的微電極記錄發(fā)現(xiàn)，USCs產(chǎn)生的心肌細胞與正常心肌細胞有類似的電學特性，可用于心臟修復。Cao等[40]從患有室間隔缺損心力衰竭患者的尿液樣品中分離出了無整合的iPSC，并使用仙臺病毒載體在RyR2基因中進行L2483R突變，通過小分子經(jīng)典Wnt信號的調(diào)節(jié)，USCs快速且有效地分化為功能性心肌細胞，經(jīng)過適當?shù)姆只瓦M一步篩選分子，它們可以進一步分化成相當數(shù)量的收縮同步的成熟心肌細胞，以修復心臟損傷。

2.7USCs在糖尿病治療中的應用 糖尿病是增長最快的慢性疾病，是降低患者生活質(zhì)量和生存率的重要原因，且伴有較多并發(fā)癥，如糖尿病心肌病、腎病、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變和膀胱病變[41]。世界衛(wèi)生組織預測，2020年全球?qū)⒂?.8億糖尿病患者[30,42]。胰島β細胞移植需要大量細胞(10 000個胰島當量/kg)才能成功替代病變的胰島功能[43]。因此，前體細胞的選擇是實現(xiàn)移植所需細胞數(shù)量的基礎。此外，用于再生療法的細胞必須滿足其他一般干細胞的特征，并以可重復的方式分化成多個譜系細胞。Dong等[44]通過尾靜脈注射USCs治療糖尿病的研究顯示，USCs雖然沒有使患者空腹血糖降至正常水平，但是對心肌、腎小球、逼尿肌的纖維化和凋亡有明顯的抑制作用，防治糖尿病并發(fā)癥。Jiang等[45]通過靜脈注射USCs外泌體抑制胱天蛋白酶3過表達促進血管再生和腎小球內(nèi)皮細胞增殖，減少了足細胞凋亡和腎小管上皮細胞凋亡，說明USCs外泌體可以預防糖尿病引起的腎臟并發(fā)癥。

2.8USCs 在其他醫(yī)學研究中的應用 Cai等[46]采用無融合的人尿誘導的iPSC產(chǎn)生牙齒樣結(jié)構(gòu)，檢測發(fā)現(xiàn)iPSC分化成上皮片，這些薄片發(fā)育成類似于牙齒狀結(jié)構(gòu)的成釉細胞，具有與正常人牙齒相似的彈性模量和硬度等物理性質(zhì)。人肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ)僅占肺泡內(nèi)襯物的5%，對肺泡修復和維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要。Wang等[47]采用四階段培養(yǎng)法誘導USCs分化為AT-Ⅱ細胞，這些細胞與正常人AT-Ⅱ細胞的表型特性相似(如伸展和上皮樣形態(tài)以及AT-Ⅱ細胞的特異性表達標志物)，在肺病細胞治療和再生醫(yī)學有巨大的應用前景。軟骨缺陷會限制關(guān)節(jié)活動，造成疼痛、生活質(zhì)量下降，Chen等[48]發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸和USCs混合物可以刺激軟骨缺陷兔膝關(guān)節(jié)中更多新軟骨的形成，可作為未來治療軟骨相關(guān)缺陷的潛在細胞來源。

3 小 結(jié)

由于USCs具有易于分離和培養(yǎng)、非侵入性、高增殖效率和穩(wěn)定的核型、無致瘤性等優(yōu)點被應用于再生醫(yī)學領(lǐng)域。盡管USCs的研究與其他自體干細胞存在差距，但有報道表明，USCs可作為組織工程中種子細胞的新來源[49]。USCs多向分化潛能還可用于組織工程修復重建、疾病治療、藥物毒性篩選等，但USCs用于臨床治療仍需要更全面的臨床前分析和標準化應用程序。