脫細(xì)胞技術(shù)及其在眼表重建組織工程中的應(yīng)用研究

陳芳圓，周清

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,廣州 510630)

自1987年首次提出“組織工程”概念以來，人們開始嘗試用組織工程學(xué)方法修復(fù)替代受損的眼表組織，組織工程角膜/結(jié)膜也隨之產(chǎn)生，對于尋找合適的眼表重建替代材料非常重要。支架材料作為組織工程三大要素(支架材料、種子細(xì)胞、生長因子)之一，其構(gòu)建是組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前組織工程支架材料包括天然材料、生物可降解材料及人工復(fù)合材料三大類[1]。與其他支架材料相比，天然材料中的脫細(xì)胞基質(zhì)具備以下優(yōu)點(diǎn)：①良好的生物相容性、免疫原性和細(xì)胞黏附性；②為細(xì)胞提供合適的生存環(huán)境，在細(xì)胞發(fā)育過程中指導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、成熟和遷移[2]；③三維立體空間結(jié)構(gòu)為細(xì)胞生長和代謝交換提供了空間。人們普遍認(rèn)為天然材料是構(gòu)建支架的理想材料。現(xiàn)就脫細(xì)胞支架的制備方法 (化學(xué)方法、物理方法和生物方法等)、脫細(xì)胞技術(shù)及其在眼表重建組織工程中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 脫細(xì)胞支架制備方法

細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix,ECM)是指通過化學(xué)、物理、生物方法對組織器官進(jìn)行脫細(xì)胞后，最終獲得的結(jié)構(gòu)和功能蛋白復(fù)合體[3]，即脫細(xì)胞支架。目前脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建的支架已成功運(yùn)用于心臟[4]、肝臟[5]、肺臟[6]以及皮膚[7]等器官和組織。理想的脫細(xì)胞支架應(yīng)該具備以下特點(diǎn)：①具有與人類正常組織相似的生物學(xué)特性；②無免疫原性；③無毒性；④具有功能性活性ECM。目前脫細(xì)胞的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法。

1.1化學(xué)制備方法

1.1.1表面活性劑 表面活性劑是最常見的脫細(xì)胞劑，通過破壞細(xì)胞膜磷脂裂解細(xì)胞，促使細(xì)胞膜溶解，破壞遺傳物質(zhì)，從而有效地從組織中去除細(xì)胞物質(zhì)[8]。表面活性劑包括離子型、非離子型和兩性離子型3種。表面活性劑對ECM蛋白和DNA的清除率隨使用時(shí)間的延長而增加，并且多種活性劑聯(lián)合使用會(huì)增加ECM蛋白的損失[9]。與酶和滲透溶液相比，非離子型表面活性劑如曲拉通Triton X-100常用于去除較厚組織的細(xì)胞成分[10]，減輕細(xì)胞免疫反應(yīng)；但在較為致密的組織器官中，如腎[11]、顳下頜關(guān)節(jié)[12]，離子型表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS) 的脫細(xì)胞效果優(yōu)于非離子型表面活性劑，且保留了組織力學(xué)。脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SD)是另一種常用的離子型表面活性劑。與SDS不同，SD脫細(xì)胞基質(zhì)具有高度生物相容性，表現(xiàn)出更高的代謝活性[13]，雖然SD對組織的破壞力較小，但其能引起組織表面DNA凝集[14]，因此SD溶液常與DNA酶 Ⅰ 合用，分解組織的天然DNA。兩性離子型表面活性劑3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸能較有效地去除肺等較薄組織中的細(xì)胞，對于較厚組織，即使與SDS聯(lián)合使用，脫細(xì)胞效果也可能較差[15]。

1.1.2低滲溶液與高滲溶液 低滲和高滲溶液通過改變細(xì)胞內(nèi)的滲透壓發(fā)揮作用。低滲溶液通過滲透效應(yīng)松解組織，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，從而達(dá)到脫細(xì)胞的目的，常與表面活性劑聯(lián)合使用，提高溶細(xì)胞效果。在脫細(xì)胞后期，常使用高滲鹽溶液增加核酸的溶解度以清除洗脫支架中殘存的遺傳物質(zhì)。上述方法操作簡便，但脫細(xì)胞效果不佳，且需時(shí)間較長，易造成組織水腫，故很少單獨(dú)應(yīng)用。

1.1.3酸/堿溶液 酸/堿溶液是通過催化水解細(xì)胞膜和細(xì)胞核獲得脫細(xì)胞組織[16]。過氧乙酸是最常用的酸溶液，具有很強(qiáng)的腐蝕性和強(qiáng)氧化性，常用作殺菌劑，或用于較薄組織的脫細(xì)胞，如小腸黏膜下層[13]。與化學(xué)和酶消化法相比，堿性溶液在脫細(xì)胞過程中能完全消除基質(zhì)中的生長因子，破壞膠原纖維，從而降低脫細(xì)胞基質(zhì)片的機(jī)械性能[17]。堿性溶液常用于脫細(xì)胞早期去除真皮樣品中的毛發(fā)[18]。

1.1.4醇類 甘油通過脫水和裂解細(xì)胞發(fā)揮脫細(xì)胞作用[19]，該方法主要適用于皮膚等含脂類較多的組織脫細(xì)胞。

1.2物理制備方法

1.2.1高靜壓技術(shù) 高靜壓技術(shù)是通過損傷組織中細(xì)胞的細(xì)胞膜，影響細(xì)胞內(nèi)酶活力以及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和廢棄物的運(yùn)輸，從而使細(xì)胞裂解。與化學(xué)制備方法相比，高靜壓技術(shù)脫細(xì)胞過程中不添加化學(xué)溶液，避免了溶劑毒性對組織的損傷，且脫細(xì)胞所需時(shí)長較短,對血管或角膜組織脫細(xì)胞的效果優(yōu)于表面活性劑和酶消化，但脫細(xì)胞過程中冰晶的形成會(huì)影響ECM的超微結(jié)構(gòu)[20]。

1.2.2凍融法 凍融是利用低溫(-80 ℃)冷凍過程中形成的細(xì)胞內(nèi)冰晶破壞細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，然后再升至室溫(37 ℃)融解，多次反復(fù)凍融使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，從而達(dá)到脫細(xì)胞的目的。研究表明，脫細(xì)胞過程中多次凍融循環(huán)不影響ECM的超微結(jié)構(gòu)，也不會(huì)減少ECM中的蛋白成分[21]。使用該方法時(shí)可加入冷凍保護(hù)劑，如5%海藻糖。單一凍融法無法獲得較好的脫細(xì)胞效果，為制備高質(zhì)量脫細(xì)胞基質(zhì)常聯(lián)合其他方法[22-23]。

1.3生物制備方法

1.3.1酶消化 目前用于脫細(xì)胞的酶包括核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、磷脂酶A2、嗜熱菌蛋白酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶等，酶消化法具有高度特異性，但僅靠酶消化法很難徹底去除細(xì)胞，且殘留在脫細(xì)胞支架上的酶可能會(huì)引起不良反應(yīng)。核酸酶雖然是一種特異性的DNA或RNA降解酶，但由于分子量較大，使用后不易清除，殘留的核酸酶可引起免疫排斥反應(yīng)。胰蛋白是脫細(xì)胞常用的蛋白水解酶之一，常作為脫細(xì)胞的第一步，破壞組織亞顯微結(jié)構(gòu)，增加脫細(xì)胞劑的滲透力。胰蛋白酶可使脫細(xì)胞組織失去機(jī)械穩(wěn)定性，其對ECM的破壞程度與作用時(shí)間成正比[24]。磷脂酶A2能夠水解細(xì)胞膜的磷脂成分，且分子量較小，易清洗，可用于豬角膜的脫細(xì)胞處理[25]。蛋白酶對ECM的去除遠(yuǎn)大于對細(xì)胞膜的消化，其破壞了胞外基質(zhì)間的連接，造成層粘連蛋白、纖粘連蛋白、蛋白多糖的大量丟失[26]。

1.3.2非酶類 螯合劑如乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸等能夠與中心金屬離子牢固地結(jié)合形成環(huán)狀分子復(fù)合物，有助于細(xì)胞從ECM蛋白上解離，達(dá)到脫細(xì)胞的目的[27-28]。由于蛋白質(zhì)之間的相互作用，螯合劑可能破壞蛋白質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)[29]。

2 眼表組織脫細(xì)胞支架的制備

如上所述，脫細(xì)胞支架制備方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，一般采用兩種或兩種以上的方法聯(lián)合脫細(xì)胞，在最大化脫細(xì)胞的前提下，更多地保存ECM的生理結(jié)構(gòu)和生物活性,減少不良反應(yīng)。聯(lián)合多種脫細(xì)胞方法逐漸成為制備眼表組織(包括脫細(xì)胞角膜/結(jié)膜)脫細(xì)胞支架的主流，脫細(xì)胞試劑的選擇取決于組織細(xì)胞的數(shù)量、密度、脂質(zhì)含量和厚度[30]。

2.1脫細(xì)胞角膜基質(zhì) 角膜疾病是第二位致盲原因,大部分為角膜基質(zhì)缺損。對于角膜盲,角膜移植是唯一有效的方法[31],但因角膜移植供體缺乏,使其在臨床應(yīng)用中受到限制，研發(fā)有效的角膜代替品是解決角膜供體不足的重要方法，但諸多人工合成材料的效果均不理想[32]，于是人們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。

2.1.1化學(xué)與生物聯(lián)合法 目前，獲取脫細(xì)胞角膜基質(zhì)最常用的方法是化學(xué)與生物聯(lián)合法[25-26,30,33-36]。SDS是一種常用的離子洗滌劑。研究發(fā)現(xiàn)，用0.5%SDS制備的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)理化性質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)和生物相容性更理想[37]，并認(rèn)為角膜組織在0.5%SDS、4 ℃條件下處理24 h后能有效溶解角膜細(xì)胞和核膜[26,34,38-40],聯(lián)合相關(guān)酶如0.25%的胰蛋白酶室溫消化4 h[35],或用200 U/mL DNase-RNase 37 ℃降解48 h[30]，能清除殘留在組織支架上的化學(xué)物質(zhì)或酶,增強(qiáng)脫細(xì)胞效果。

張超等[35]用1%Triton-100聯(lián)合0.25%胰蛋白酶、DNase-RNase對豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，掃描電鏡下顯示細(xì)胞成分去除干凈，并保留了組織的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。將脫細(xì)胞豬角膜植入新西蘭大白兔角膜板層囊袋后未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，基質(zhì)位置良好，電鏡下見基質(zhì)與角膜組織間無縫隙，融合生長良好[35]。該研究為組織工程角膜研究奠定了基礎(chǔ)。有學(xué)者曾多次用0.5%SDS+蛋白酶抑制劑脫豬角膜緣上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中DNA含量明顯減少，三維超微結(jié)構(gòu)保留完好，未出現(xiàn)化學(xué)溶劑毒性反應(yīng)[30,34,40]。

2.1.2物理與化學(xué)/生物聯(lián)合法 利用機(jī)械力破壞細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞溶解。雖然有學(xué)者報(bào)道僅用高靜壓技術(shù)(壓強(qiáng)980 Mpa;溫度10 ℃或30 ℃;時(shí)間10 min)就可制備脫細(xì)胞角膜基質(zhì)[41-42]，但更多學(xué)者認(rèn)為還需聯(lián)合化學(xué)或生物方法,如聯(lián)合1%～2%TritonX-100或40 U/mL DNase-Rnase等才能將細(xì)胞碎片等清除，從而得到較純凈的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)[22,42-44]。

Lin等[22]用反復(fù)凍融法聯(lián)合2.5%胰蛋白酶和40 U/mL DNase-RNase酶消化法對豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，體外檢測后將直徑為6.5 mm的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)片植入12只新西蘭大白兔的角膜基質(zhì)層囊袋中，分別于術(shù)后第 1、4、8、32周切取全層角膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12只新西蘭大白兔未出現(xiàn)臨床和組織學(xué)排斥反應(yīng)，在體內(nèi)重建后脫細(xì)胞角膜基質(zhì)與受體角膜結(jié)合并逐漸透明。

隨著角膜組織工程技術(shù)的成熟，由我國研究開發(fā)的全球第一個(gè)可臨床使用的生物工程角膜(艾欣瞳)于2015年5月正式投入臨床[45]。該產(chǎn)品為脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì),能促進(jìn)角膜上皮再生及基質(zhì)合成,減少新生血管生成,具有良好的生物相容性,且結(jié)構(gòu)接近正常角膜基質(zhì),有利于細(xì)胞的長入，移植后能與原有的角膜組織整合,從而終身使用。

2.2脫細(xì)胞組織工程結(jié)膜 結(jié)膜是覆蓋于眼瞼后和眼球前的一層半透明黏膜，包括瞼結(jié)膜、球結(jié)膜和穹隆結(jié)膜，主要功能是維持淚液動(dòng)態(tài)平衡，是構(gòu)成眼表的第一道防護(hù)線。當(dāng)各種致病因素?fù)p害結(jié)膜上皮，特別是杯狀細(xì)胞時(shí)，眼表屏障遭到破壞，致使淚液成分改變，淚膜不穩(wěn)定，導(dǎo)致眼表功能喪失。過去有學(xué)者嘗試用羊膜重建因化學(xué)燒傷、翼狀胬肉手術(shù)后[46]、瘢痕性類天皰瘡[47]以及Stevens-Johnson 綜合征[48]等受損的眼表，但發(fā)現(xiàn)羊膜存在退化時(shí)間快、易于復(fù)發(fā)瘢痕以及瘢痕形成不足等缺點(diǎn)[47,49]。

目前脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)技術(shù)尚未成熟，最常采用化學(xué)與生物聯(lián)合法如0.05%～0.1%SDS聯(lián)合1 U/mL核酸酶制備[50-52]。Kasbekar等[53]分別用濃度為0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、0.5%(w/v)的SDS、1 U/mL核酸酶對人結(jié)膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的DNA定量、膠原蛋白變性、細(xì)胞毒性以及抗張強(qiáng)度與天然結(jié)膜組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3種濃度相比，濃度為0.05%(w/v) 的SDS可去除99%的DNA。將上述基質(zhì)片干燥消毒后，體外培養(yǎng)人球結(jié)膜細(xì)胞28 d發(fā)現(xiàn)，支架可支持復(fù)層結(jié)膜上皮生長，并引導(dǎo)組織分化為上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，證明其在眼表疾病的治療中有潛在價(jià)值。

Zhao等[52]將角膜緣干細(xì)胞缺損模型分別在脫細(xì)胞結(jié)膜支架[0.1%(w/v)SDS]和脫細(xì)胞羊膜支架進(jìn)行角膜上皮移植，并觀察角膜生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞結(jié)膜組脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)中92%以上的DNA被去除，同時(shí)保留了90%以上的ECM成分(糖胺聚糖和膠原)。與脫細(xì)胞羊膜相比，脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的透光率、抗拉強(qiáng)度、穩(wěn)定性、生物相容性和抗降解能力更好，重建角膜上皮的效果也優(yōu)于脫細(xì)胞羊膜支架組，證實(shí)了以脫細(xì)胞結(jié)膜為基礎(chǔ)的組織工程化角膜上皮在角膜緣干細(xì)胞缺乏癥的眼表重建中的有效性，為異種脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)用于眼表重建奠定了基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，對于體內(nèi)異種移植后結(jié)膜重建，豬源和人源脫細(xì)胞結(jié)膜優(yōu)于羊膜[51,54]。

3 問題與展望

生物工程制備的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)作為較理想的角膜替代材料已開始應(yīng)用于臨床，但生物工程角膜材料的免疫原性在應(yīng)用中是否會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)及出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)后藥物是否可控一直是眼科醫(yī)師關(guān)注的焦點(diǎn)[55]。隨著研究的深入,相信生物工程角膜能夠在角膜眼表領(lǐng)域發(fā)揮更大的潛能，打破我國角膜供體資源不足的限制。但目前脫細(xì)胞結(jié)膜技術(shù)尚未成熟，對于嚴(yán)重結(jié)膜疾病患者缺乏有效的治療方案，在以后的實(shí)驗(yàn)中探索更有效、標(biāo)準(zhǔn)化的脫細(xì)胞結(jié)膜方案，以實(shí)現(xiàn)最佳的ECM保存，深入探討脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的制備，使脫細(xì)胞結(jié)膜生物成品的制作成為可能，為結(jié)膜疾病的診療提供新的方法。