三維打印技術(shù)在骨組織工程中的應用進展

張鑫,王新濤

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科，哈爾濱 150081)

近年來，由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因?qū)е麓竺娣e骨缺損的患者越來越多，故如何治療骨缺損成為骨科醫(yī)師有待解決的問題。Hayrapetyan等[1]發(fā)現(xiàn)，骨組織在一定范圍內(nèi)具有很強的再生能力。當前骨缺損的治療主要依靠自體、同種異體和異種骨移植等，但均未取得良好效果。骨組織工程學由Grane等[2]于1995年提出。骨組織工程學是將支架與細胞和細胞因子復合，隨后將構(gòu)建好的骨組織工程支架移植到骨缺損區(qū)域，以新生骨組織替代支架材料，從而修復骨缺損[3]，其包括支架載體、種子細胞和細胞因子3個基本要素。其中支架作為一種臨時的、人工的細胞外基質(zhì)，能夠促進新骨形成[4]，對細胞的增殖和分化有直接影響[5]。理想的骨組織工程支架應具備適宜的孔隙率及表面積比、較好的生物相容性、表面活性及與臨床應用匹配的外形，并能夠促進細胞黏附及血管、神經(jīng)的生長[6-7]。骨組織支架材料包括生物陶瓷、天然生物材料、人工合成材料等。應用常規(guī)技術(shù)制備的骨組織工程支架仍存在許多缺點，如支架無法個體化制備，無法控制支架孔隙率、孔徑大小、孔隙之間的連通率，且細胞在支架載體上的黏附率低[8]。經(jīng)過不斷的嘗試，研究者最終將三維打印技術(shù)應用到骨組織工程中，制備出了理想的骨組織工程支架?，F(xiàn)對三維打印技術(shù)在骨組織工程中的應用進展予以綜述。

1 三維打印技術(shù)

三維打印技術(shù)也稱增材制造，是根據(jù)CT、磁共振成像等數(shù)據(jù)重建模型或計算機輔助設計的數(shù)據(jù)，通過將材料精確的分層堆積，快速打印出與骨缺損區(qū)域幾乎完全相同的三維多孔高活性骨修復支架[9]。該技術(shù)由美國學者在20世紀90年代研制成功，其機制是以能夠固化的材料分層疊加的方式實現(xiàn)快速成型的技術(shù)[10]。

三維打印技術(shù)具有準確度高、快速及可定制等優(yōu)點，其越來越廣泛地應用于生物醫(yī)學領域。在影像學和數(shù)字化醫(yī)學的幫助下，醫(yī)師可以利用三維打印技術(shù)打印所需要的特定模型，從而獲得更加全面的信息。臨床醫(yī)師可以通過模型進行模擬性手術(shù)，從而制訂更全面、更優(yōu)化的手術(shù)方案，縮短手術(shù)時間，提高成功率，減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生[11-12]。Xu等[13]以三維圖像數(shù)據(jù)為基礎，使用三維打印方法成功制備了樞椎椎體，同時成功進行了三維打印人工椎體置換、頸椎椎體全切脊柱重建術(shù)，術(shù)后患者恢復良好。在醫(yī)學中，最常用的技術(shù)為熔融沉積建模(fused deposition modeling，F(xiàn)DM)、選擇性激光燒結(jié)(selective laser sintering，SLS)和立體光刻(stereolithography，SLA)[14]。

1.1FDM FDM是一種以擠出為基礎的技術(shù)，其是將熱塑性塑料或復合長絲加熱到半熔融狀態(tài)，然后通過計算機控制的噴嘴擠出。目前，關(guān)于FDM的優(yōu)點和局限性仍存在爭議。Liu等[15]報道，F(xiàn)DM技術(shù)可以利用醫(yī)用級丁腈苯乙構(gòu)建堅固的骨模型、植入物，丁腈苯乙是一種可以在手術(shù)前進行適當消毒的材料。但Garg和Mehta[14]報道，雖然FDM比SLS和SLA速度更快、價格更低，但該技術(shù)的準確性較低，而且由于所用材料的熔點低，在手術(shù)前消毒方面存在一定困難。因此，建議僅在術(shù)前使用FDM。目前，還不能確定FDM是否可以在術(shù)中使用。

1.2SLA SLA是一種基于還原聚合的印刷，當激光束射入光固化液體樹脂后，樹脂逐層固化-從液體轉(zhuǎn)向固體聚合物(稱為光聚合)-直到三維結(jié)構(gòu)打印完成。SLA是第一個獲得專利的三維打印技術(shù)，廣泛應用于各個醫(yī)療領域。個性化設計、大規(guī)模定制、利用最大化和制造復雜結(jié)構(gòu)的能力是SLA作為一種制造技術(shù)的主要優(yōu)勢。SLA打印機可以生產(chǎn)出表面光滑的物體，但是光致聚合物建筑材料相對昂貴。Li等[16]采用間接SLA法制備了微孔β磷酸三鈣，并采用該工藝制備了樹脂模具，填充了熱固性陶瓷水基懸浮液，用于陶瓷凝膠澆注。采用熱處理工藝去除樹脂模具。結(jié)果表明，燒結(jié)后的β磷酸三鈣材料具有理想的孔隙率、形狀和較高的強度。也有研究通過紫外光激光以分層方式光固化液體樹脂來制備3D物體[17-18]。SLA的主要優(yōu)點為制備出的3D物體具有更好的表面光潔度和更高的精度[19]。

1.3SLS 在SLS中，高能激光束產(chǎn)生局部熱源，該熱源將粉末材料部分熔化并融合成所需的圖案。熱源一次熔合一層，直到生成三維結(jié)構(gòu)。在SLS中，金屬合金和陶瓷是使用最多的材料。SLS技術(shù)具有很高的精度，可以打印小至(0.5±0.2) mm的三維模型[15]。然而，Liaw和Guvendiren[20]指出，由于粉末材料處于半熔融狀態(tài)，故SLS的最終產(chǎn)品具有粗糙、研磨的表面和多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此，SLS打印通常需要更多的后處理。Hoffmann等[21]采用SLS技術(shù)制備鎳鈦合金多孔支架，然后將打印好的支架與間充質(zhì)干細胞在體外共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞可以沿著成骨譜系增殖、分化，具有良好的生物活性，能夠縮短患者恢復期。

2 三維打印技術(shù)與骨組織工程

三維打印技術(shù)通過影像學收集骨缺損的數(shù)據(jù)，借助計算機的輔助，設計出較為理想的三維立體結(jié)構(gòu)，再選用理想的材料，制備出合適的骨組織工程支架。與傳統(tǒng)方法相比，三維打印技術(shù)具有以下優(yōu)勢：全自動化，操作簡便、打印速度快，可以重復打??；無需特殊工具，能夠根據(jù)患者實際情況進行個體化制備；能夠打印出具有理想的孔隙率和孔徑的支架；多種細胞、細胞因子以及基因均能夠同步打印到支架的指定部位[22-23]。

2.1三維打印生物材料 近年來，骨組織工程及再生醫(yī)學不斷進步,三維打印技術(shù)在開發(fā)和制造由仿生天然和合成材料組成的仿生支架方面應用更加廣泛。骨組織工程中的打印材料需具有一定的機械性能、骨誘導性及骨傳導性，同時具備良好的生物降解性，一般可分人工合成多聚體類、生物陶瓷、天然高分子聚合物等。

2.1.1人工合成多聚體類 以聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物為代表的人工合成多聚體，具有良好的生物相容性，無毒的降解產(chǎn)物，可通過體內(nèi)代謝排出，但這些材料在親水性及機械強度等方面存在不足[7]。較早的組織工程支架大多經(jīng)紡織技術(shù)將聚羥基乙酸等材料的纖維制造成骨架。由于該支架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，力學性能不足，不能用于硬組織培養(yǎng)。而Pati等[24]應用多個噴頭打印出聚己內(nèi)酯/聚乳酸/β磷酸三鈣復合生物材料支架，并將骨髓間充質(zhì)干細胞與支架復合培養(yǎng)，將干細胞分泌的細胞外基質(zhì)附著于支架上，然后保留細胞外基質(zhì)并去除干細胞，制備出聚己內(nèi)酯/聚乳酸/β磷酸三鈣/細胞外基質(zhì)支架，該支架既可以達到生物力學要求，又可以加速生物礦化過程。Xu等[25]通過熱致相分離與三維打印技術(shù)制造了聚乳酸-羥基乙酸共聚物/天然珍珠的復合三維支架，該支架具有較高的孔隙率、合適的孔徑和一定機械性能，將其與骨髓干細胞進行復合培養(yǎng)，干細胞能夠進行良好的增殖與分化，證明其具有生物相容性和骨誘導性，能達到骨組織工程中支架的要求。

2.1.2生物陶瓷 磷酸鈣鹽陶瓷是骨組織工程支架應用最多的材料，其中羥基磷灰石和磷酸三鈣最具代表性。羥基磷灰石有良好的骨傳導性、骨誘導性、生物相容性、無細胞毒性等優(yōu)點，同時其還能刺激成骨生長因子(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白)的內(nèi)源性表達，并增強間充質(zhì)干細胞中堿性磷酸酶的活性，但其也有脆性大、不易塑型和不易降解等不足[26-28]。Adel-Khattab等[29]以含有鈣磷酸鈣的二氧化硅為材料，以Schwartzwalder Somers方法和3D打印技術(shù)制備支架，在體外檢測了支架的機械性能和物理性質(zhì)(孔隙率、壓縮強度、溶解度)，同時將兩種方法制備的支架與鼠成骨細胞(MT3T3-E1)共同培養(yǎng)7 d發(fā)現(xiàn)，Schwartzwalder Somers方法制備的支架總孔隙率(86.9%)明顯高于3D打印技術(shù)制備的支架(50%)，但3D打印技術(shù)制備的支架內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)更多，擁有更高的抗壓強度和二氧化硅釋放功能，表明3D打印技術(shù)制備的支架具有良好的機械和生物學特性。Roohani-Esfahani等[30]采用三維打印的方法制備了具有六方孔結(jié)構(gòu)的微晶玻璃支架。與具有相同孔隙率的陶瓷-玻璃支架相比，其所制造的支架具有150倍的強度，表明這些支架具有優(yōu)異的承載和節(jié)段性骨缺損治療能力。

2.1.3天然高分子聚合物 天然高分子聚合物，也稱為生物衍生材料，存在于自然界中，可以通過物理或化學方法提取。這些聚合物已廣泛應用于許多工業(yè)領域，如食品、紡織品、紙張、木材、黏合劑。天然高分子聚合物包括膠原、藻酸鹽、淀粉等，它們具有良好的生物相容性及細胞識別信號，能夠促進細胞的增殖、黏附及分化。天然高分子聚合物、具有良好的水溶性，且容易與黏結(jié)劑結(jié)合，可以廣泛用于3D生物技術(shù)打印的組織工程支架。但它們難以大量獲取，降解時難以控制，缺乏一定的機械強度，不足以作為理想的支架載體，但可作為良好的添加劑[31]。近年來有學者將其應用于骨組織工程中，Yu等[32]以納米羥基磷灰石和聚(酯脲)為材料，通過熔融沉積模型打印出孔隙率為75%的三維多孔支架，隨后將MC3T3-E1細胞與該支架復體外復合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在羥基磷灰石含量高的支架中，通過提高堿性磷酸酶活性、增加成骨細胞基因和蛋白的表達以及促進礦化，細胞能夠長期處于高分化狀態(tài)，羥基磷灰石表面能夠賦予支架骨誘導性和骨傳導性，使該支架在骨組織工程方面優(yōu)于其他聚合物支架。Ren等[33]通過生物打?、蛐湍z原水凝膠構(gòu)建具有梯度軟骨細胞密度的工程化帶狀軟骨，Ⅱ型膠原具有維持軟骨細胞表型的能力，并在促進軟骨細胞分化方面發(fā)揮重要作用。3D打印的帶狀軟骨具有梯度細胞外基質(zhì)分布，其與軟骨細胞密度呈正相關(guān)。

2.2三維打印細胞和細胞因子 現(xiàn)有制備組織工程骨的方法大多是在支架上接種細胞，細胞與支架在體外共同培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，移植到患者體內(nèi)，隨著細胞的增殖、分化以及支架的降解，最后以新生骨組織替代支架材料。但此種方法只是將細胞與支架整合到一起，沒有達到預期的效果[34]。三維打印技術(shù)可將細胞接種在支架的指定位置，還可以將細胞因子添加到支架中，促進細胞的增殖和黏附，這樣能夠同步控制打印支架材料、細胞和細胞因子[35]。

細胞是骨組織工程的三大要素之一，其用于三維打印主要考慮以下幾個因素:①能夠在體外大量培養(yǎng)；②支架中的細胞還具有增殖和分化能力；③打印后的細胞具有活性；④細胞類型不同且之間存在差異；⑤多種細胞共同參與組織發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導[36-39]。隨著三維打印技術(shù)的不斷成熟，細胞打印也取得了一定的進展。Li等[40]應用三維打印技術(shù)，以羥丙基甲殼素為生物墨水，成功打印人類誘導多功能干細胞，培養(yǎng)10 d后發(fā)現(xiàn)打印出的細胞存活率>90%且表現(xiàn)出較高的增殖效率。與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)相比，在三維印刷結(jié)構(gòu)中形成的人類誘導多功能干細胞團表現(xiàn)出更高的均勻性。采用新的雙熒光標記方法，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建物中的人類誘導多功能干細胞聚集物更傾向于原位增殖而不是多細胞聚集。同時發(fā)現(xiàn)三維打印的細胞具有產(chǎn)量高、聚集性均勻等特點。Cui等[41]將活的軟骨細胞與聚乙二醇二甲基丙烯酸酯混合，成功制造出能夠打印的生物墨水，同時結(jié)合紫外光，制備出水凝膠修復支架。結(jié)果表明，軟骨細胞在水凝膠軟骨支架中呈現(xiàn)均勻分布，且直接紫外光照射打印的支架細胞的存活率較先沉積后光照聚合打印的支架細胞高26%。Gao等[42]通過噴墨打印技術(shù)，將懸浮聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的人骨髓間充質(zhì)干細胞、生物活性玻璃和羥基磷灰石的納米顆粒3種混合的物質(zhì)共同打印，成功制備支架。與單純聚乙二醇二甲基丙烯酸酯支架相比，該復合支架上的細胞能夠精確到達目標位置，細胞存活率達(86.62±6.02)%，支架中的羥基磷灰石對人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化和成骨細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生有顯著的促進作用，該支架細胞毒性最小。

細胞因子有促進細胞增殖和分化等作用。有研究將打印好的支架與生物活性因子相復合，再植入到動物體內(nèi)進行骨缺損的修復[43]。且利用三維打印同步裝配細胞因子具有很多優(yōu)點，它能夠準確地構(gòu)建接近人體內(nèi)微環(huán)境的復雜三維結(jié)構(gòu)。Ritz等[44]以聚乳酸為材料，采用三維打印技術(shù)打印出形狀為多孔籠狀的支架載體，并在籠中添加基質(zhì)細胞衍生因子1，該支架較單純的聚乳酸支架的內(nèi)毒素污染低，機械穩(wěn)定性較好，同時利于內(nèi)皮細胞的生長及誘導新生血管形成。Cooper等[45]采用噴墨印刷技術(shù)進行支架打印，通過噴墨濃度來調(diào)節(jié)生長因子在支架個別位置上的濃度；不需要定制模板來創(chuàng)建特定的模式，實驗周轉(zhuǎn)時間相對較快；噴墨打印的分辨率足以產(chǎn)生較快的細胞生物反應。

3 問題與展望

三維打印是一種新型數(shù)字化成型技術(shù)，它的出現(xiàn)為骨缺損的修復提供了一種全新的方法，但目前三維打印技術(shù)還存在許多缺點和不足：①在醫(yī)學領域三維打印技術(shù)的打印、所需材料及設備費用較高，這導致其不能進行大批量打印，從而限制了臨床應用。②對于骨組織，單純的水凝膠、膠原打印的支架載體機械性能及生物性能無法達到支架要求，雖然當前能夠通過共印熱塑性聚合物來增加機械強度，但是部分無機材料在不進行高溫燒結(jié)的情況下并不能取得所需的生物力學效果[46]，目前植入物是否有機械強度仍存在爭議。③三維組織/器官打印技術(shù)的目的均是重塑復雜器官的微觀結(jié)構(gòu)，該過程不僅耗時長,且對細胞數(shù)量要求巨大，細胞經(jīng)過長時間打印，其存活率降低的同時，打印體的生物功能也可能會發(fā)生變化。這些缺陷和不足是推動三維打印技術(shù)的動力，只有消除存在的缺點，三維打印技術(shù)才能更快的發(fā)展。相信未來三維打印技術(shù)在骨組織工程領域中將會更廣泛的應用。