外泌體在乳腺癌病理診斷中的應(yīng)用進展

陳麗娥，謝謝，王識華

(1.海南省第三人民醫(yī)院病理科，海南 三亞 572000； 2.解放軍聯(lián)勤保障部隊三亞康復(fù)療養(yǎng)中心健康管理部，海南 三亞 572000)

乳腺癌作為一種女性多發(fā)惡性腫瘤，約占全部女性惡性腫瘤的20%，國內(nèi)患病率約為26/10萬[1]。目前，乳腺癌的早期診斷方法包括臨床體格檢查、影像學(xué)檢查、血清學(xué)標志物等，但這些傳統(tǒng)診斷技術(shù)的敏感性和特異性不高，因此乳腺癌早期仍有相對較高的誤診和漏診率，這也是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不佳的重要原因之一[2-3]。為找到更為敏感且準確的診斷標志物，近年與乳腺癌早期診斷相關(guān)的分子生物學(xué)逐漸成為研究重點。膜泡運輸是細胞內(nèi)外物質(zhì)進行轉(zhuǎn)運的主要方式，轉(zhuǎn)運時細胞膜常以囊泡的形式存在，包裹蛋白質(zhì)、核酸、多糖等一系列物質(zhì)[4]，其中也包含外泌體。外泌體是一類活細胞自體分泌的囊泡小體，這類囊泡小體包裹核酸、蛋白質(zhì)及RNA等物質(zhì)[5]，直徑為40～100 nm[6]。外泌體包含起源細胞的遺傳信息，其釋放進入外循環(huán)后，在循環(huán)系統(tǒng)均勻并穩(wěn)定存在，這種獨特的分布特性使其成為乳腺癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測的新型腫瘤標志物[7-8]?，F(xiàn)就外泌體在乳腺癌病理診斷中的應(yīng)用進展予以綜述。

1 外泌體的來源、結(jié)構(gòu)及功能

外泌體是一類多形性囊泡樣小體，可由多種細胞分泌，廣泛分布于尿液、血液、滲出液、唾液等多種體液中，甚至在孕產(chǎn)婦的羊水中也有分布，且水平相對較高[9-10]。外泌體這種廣泛分布的納米級囊泡結(jié)構(gòu)小體參與了內(nèi)環(huán)境與細胞間的物質(zhì)傳遞及信息傳遞，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。細胞所處的組織部位不同，其分泌的外泌體內(nèi)容物也有所不同，且相關(guān)內(nèi)容物在組成、功能等方面也存在顯著差異。有研究指出，這種不同組織部位導(dǎo)致細胞外泌體內(nèi)容物的生物學(xué)差異與各組織所處外環(huán)境差異有關(guān)[12]。外泌體的生成受跨膜區(qū)蛋白超家族成員(如CD9、CD63)的調(diào)控，其他特異性細胞蛋白也參與了外泌體的生成和釋放[13-14]。在腫瘤細胞生成的外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化生長因子-β、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)配體等免疫抑制蛋白和腫瘤抗原。腫瘤細胞分泌并釋放的外泌體內(nèi)含有高水平的微RNA(microRNA，miRNA)，該水平的miRNA能夠參與腫瘤的自身調(diào)控，同時還能對細胞外RNA的穩(wěn)定產(chǎn)生保護作用，轉(zhuǎn)運miRNA與信使RNA至其他細胞或組織內(nèi)，可產(chǎn)生調(diào)控作用[15-16]。在肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤組織及細胞中均檢測到miRNA或相關(guān)蛋白分子[17-18]。故推測外泌體可能與惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2 乳腺癌的發(fā)生與外泌體

既往研究指出，惡性腫瘤的發(fā)生與腫瘤干細胞自我更新能力的異常改變有關(guān)[19]。腫瘤干細胞能夠加速腫瘤細胞的增殖，推動腫瘤細胞向不同類型分化；介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，推動惡性腫瘤疾病后續(xù)一系列如浸潤、轉(zhuǎn)移、增殖等不良情況的發(fā)生。在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體還會對腫瘤周圍新生血管的生成產(chǎn)生影響，加速腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤的發(fā)生，外泌體的這種促新生血管形成機制主要受體內(nèi)乙酰肝素酶、組織含氧量等因素的影響[20]。

Clayton和Tabi[21]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅能夠加速惡性腫瘤細胞周圍正常細胞的增殖，并抑制其凋亡；還能通過調(diào)節(jié)與免疫逃亡反應(yīng)相關(guān)的受體(如自然殺傷細胞2族成員D受體)，抑制機體對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)共同培育乳腺癌腫瘤細胞外泌體與外周血淋巴細胞時，自然殺傷細胞2族成員D受體陽性細胞的檢出數(shù)量顯著減少，認為淋巴細胞陽性細胞數(shù)量的減少可能介導(dǎo)了乳腺癌惡性腫瘤細胞免疫逃逸的識別和供給[22]。在之后的研究中還發(fā)現(xiàn)，使用乙酰肝素酶刺激乳腺癌細胞可導(dǎo)致外泌體大量分泌，這一結(jié)果也為臨床證實外泌體參加了腫瘤細胞的增殖及血管生成提供了依據(jù)，同時也提示外泌體可能參與并推動了惡性腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移[23]。此外，也有研究認為外泌體會影響腫瘤微環(huán)境，加速腫瘤轉(zhuǎn)化，參加腫瘤各個發(fā)展階段，加速病情惡化[24]。

3 乳腺癌早期診斷的新型生物學(xué)標志物

目前，乳腺癌的診斷主要依賴體格檢查、病理檢查、影像學(xué)檢查及血清學(xué)標志物。乳腺癌的標志物大致分為3類:①組織學(xué)標志物，如孕激素、雌激素、人類表皮生長因子2等[25]；②基因型標志物，較其他標志物的敏感性和特異性高[26]；③血清學(xué)標志物，如癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原549-muc-1等，但其特異性均不十分理想[27]。Zhang等[28]認為，檢測唾液中外泌體的水平能夠?qū)θ橄侔┰缙谧龀鰷蚀_判斷。該研究指出，乳腺癌細胞分泌的外泌體通過唾液腺分泌后，其蛋白、RNA、核酸等內(nèi)容物將發(fā)生蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變，并進一步提高表達狀態(tài)，推測外泌體包含的miRNA可用于乳腺癌的早期診斷。

4 外泌體與乳腺癌的診斷

傳統(tǒng)的乳腺癌檢查手段有乳腺鉬靶檢查和乳腺X線檢查，但這些檢查手段受乳腺腫瘤大小及病理分型的限制，且可能會對女性身體產(chǎn)生不良影響[29]。乳腺癌患者發(fā)病后機體將大量合成并分泌外泌體，外泌體水平激增，不同體液中外泌體攜帶的分子也有所不同，蛋白質(zhì)、核酸等的含量顯著增加[30]。外泌體作為乳腺癌早期診斷及監(jiān)測方法已被逐漸被認可，目前用于乳腺癌診斷的外泌體標志物包括外泌體核酸、外泌體蛋白質(zhì)。除可用于惡性腫瘤疾病的早期診斷外，外泌體還能用于腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移的評估。組織缺氧能加速惡性腫瘤細胞釋放外泌體，在相對缺氧的惡性腫瘤細胞中，高表達的外泌體將進一步促進腫瘤的增長與繁殖，惡性腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體與上皮細胞發(fā)生作用后，可間接加速腫瘤細胞的生長與遠處轉(zhuǎn)移[31]。

4.1外泌體核酸 腫瘤的發(fā)生與起源均依靠具有自我更新能力的腫瘤干細胞，這類細胞往往能加速腫瘤的增殖，推動腫瘤細胞向不同類型分化。研究認為，外泌體miRNA作為腫瘤生物標志物的前景廣泛，甚至可能改變?nèi)橄侔┰缙谠\斷與管理的手段[12]。Hannafon等[32]的研究納入了16例經(jīng)病理診斷確診為乳腺癌的患者和16例接受常規(guī)檢查證實無乳腺可疑病變的健康女性，分離健康女性與乳腺癌患者的血漿外泌體，在分離出的外泌體中提取總RNA，并選擇至少3種特異性分泌的miRNA行實時聚合酶鏈反應(yīng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿外泌體miR-21和miR-1246的表達較健康女性顯著增加。Eichelser等[33]分析了12例健康女性與50例乳腺癌患者血清外泌體中miR-372、miR-101的表達情況發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，乳腺癌患者血清外泌體miR-372、miR-101的表達水平均明顯升高，提示外泌體miRNA可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，若乳腺癌患者雌激素受體和孕激素受體均為陰性，則其體液中外泌體miR-373的水平將顯著高于雌激素受體和孕激素受體均為陽性的患者[34]。該研究認為，血清外泌體miR-373有望成為高侵襲性乳腺癌早期診斷的重要標志物[34]。目前，關(guān)于乳腺癌早期采用外泌體miRNA作為血清學(xué)標志物的相關(guān)研究較多，但有關(guān)外泌體環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA、DNA是否能用于乳腺癌早期的診斷報道較少，這可能與環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA、DNA等在外泌體內(nèi)的表達水平相對較低、檢測難度大等有關(guān)，故外泌體環(huán)狀RNA、長鏈非編碼RNA、DNA等是否可作為乳腺癌診斷及監(jiān)測的標志物還需進行更為深入的研究。

4.2外泌體蛋白質(zhì) 除外泌體核酸可用于乳腺癌的診斷外，外泌體蛋白質(zhì)在乳腺癌的早期診斷中也有較高價值。在早期乳腺癌患者的血清中，外泌體Survivin-2B呈高表達，但在高級別乳腺癌患者中，血清外泌體Survivin-2B則呈低表達甚至無表達，且遠處轉(zhuǎn)移患者也未見高表達，甚至是無表達[35]。該研究認為，血清外泌體Survivin-2B可作為早期乳腺癌血清生物標志物及預(yù)后預(yù)測評估的重要指標[35]。Moon等[36-37]分析乳腺癌患者細胞外囊泡表面生物分子的表達情況發(fā)現(xiàn)，Del-1蛋白、纖連蛋白在乳腺癌患者血漿細胞外囊泡上呈高表達，可考慮將其作為乳腺癌早期檢測評估的指標。細胞外囊泡主要包括微泡和外泌體，但是外泌體還是微泡上存在的Del-1蛋白、纖連蛋白與乳腺癌相關(guān)至今尚未明確，有待深入研究。Lee等[38]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清外泌體表面的CD47呈高表達，不僅如此，乳腺癌患者血清外泌體中血管內(nèi)皮生長因子受體、CD63、CD24也呈高表達，其中外泌體CD24高表達可能參與了乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有研究證實，發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，體內(nèi)循環(huán)外泌體表皮生長因子樣重復(fù)折疊1結(jié)構(gòu)蛋白3呈高表達，該蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能主要通過整合素黏著斑激酶介導(dǎo)，這種被整合素黏著斑激酶所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將提高癌細胞的侵襲性，加速惡性腫瘤細胞向其他重要臟器及組織的轉(zhuǎn)移，如肺轉(zhuǎn)移等[39]。此外，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，血漿外泌體骨膜素呈高表達[40]?？梢?，骨膜素與表皮生長因子樣重復(fù)折疊1結(jié)構(gòu)蛋白3聯(lián)合可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌診斷的標志物。也有研究認為，乳腺癌患者血漿熱激蛋白90α呈高表達，故該蛋白也可作為乳腺癌早期診斷的標志物，對乳腺癌的早期診斷有一定的指導(dǎo)價值[41]。目前關(guān)于外泌體熱激蛋白是否與乳腺癌有直接關(guān)系的研究不多，也無較多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持，未來需進一步驗證。

雖然目前關(guān)于外泌體蛋白質(zhì)、外泌體核酸與乳腺癌相關(guān)性的研究已經(jīng)較為深入和成熟，但這些外泌體蛋白質(zhì)及外泌體核酸與乳腺癌臨床病理分型、分期、分化程度、轉(zhuǎn)移情況等的相關(guān)性仍缺乏相對全面且系統(tǒng)的研究，且各外泌素蛋白質(zhì)及外泌素核酸用于乳腺癌診斷的價值也尚未達成共識，各外泌素蛋白質(zhì)及核酸檢測是否能兼具檢測成本低、檢出率高等優(yōu)勢也尚無相關(guān)研究加以驗證，這些均是未來需要研究與解決的問題，這對提高外泌體在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用極為關(guān)鍵。

5 小 結(jié)

外泌體及其相關(guān)內(nèi)容物可用于乳腺癌的早期診斷，且敏感性和特異性均較傳統(tǒng)生物標志物更理想。一方面，外泌體可以抑制乳腺癌細胞的增殖，經(jīng)處理后的外泌體能夠特異性靶向乳腺腫瘤細胞，延長化療藥物的半衰期，進一步提高化療效果；另一方面，在正常乳腺癌細胞中，外泌體會誘導(dǎo)致癌特性，在乳腺癌化療敏感癌細胞中誘導(dǎo)對化療藥物的耐藥。外泌體在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的這些作用尚未被系統(tǒng)且全面的證實。結(jié)合外泌體的低免疫原性的特性，未來可將其作為納米載體，進行多中心、大樣本、長時間的研究，以期為乳腺癌等惡性腫瘤疾病的診斷、基因治療、免疫治療、預(yù)后評估等提供新方向，以提高惡性腫瘤疾病的診治效果。