長鏈非編碼RNAs在擴(kuò)張型心肌病中的研究進(jìn)展

趙增，任澎

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊 830001； 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，烏魯木齊 830001)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心室擴(kuò)大和心肌功能下降為特征的異質(zhì)性心肌病，主要臨床表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大、心室收縮功能降低、心力衰竭、室性及室上性心律失常、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常、血栓栓塞和猝死，除外高血壓、先天性心臟病、心臟瓣膜病、缺血性心臟病等；多數(shù)DCM病因不清，致病因素可分為遺傳性因素、非遺傳性因素和獲得性因素，其中25%～50%的DCM與基因突變或家族遺傳密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)超過60個基因的相關(guān)突變與家族遺傳性或散發(fā)的DCM有關(guān)[1]；非遺傳性因素包括病毒、細(xì)菌、立克次體和寄生蟲感染等，可引起心肌炎并發(fā)展為DCM；部分獲得性因素包括酒精、化療藥物等心肌毒性物質(zhì)及內(nèi)分泌和代謝異常，也可導(dǎo)致心肌損傷并逐漸發(fā)展為DCM。DCM的主要病理改變是心腔擴(kuò)大，肉眼可見心室擴(kuò)張、室壁變薄、心肌纖維瘢痕，常伴有附壁血栓形成；組織學(xué)表現(xiàn)為不同程度的心肌間質(zhì)和血管周圍纖維化，心肌纖維增粗、變性、斷裂或壞死，如有炎癥過程參與，則可見多種炎癥細(xì)胞浸潤。

近年來，對于DCM的研究仍主要集中于基因突變方面，TTN、LMNA、LVRR基因均與DCM左心室重構(gòu)有關(guān)。有研究證實(shí)，二代測序技術(shù)在DCM患者中具有較高的遺傳診斷率[2]。隨著對非編碼RNA的深入研究，長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)在心臟疾病中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。最初，lncRNAs被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“遺傳垃圾”，并沒有功能意義[3]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在心血管疾病、代謝性疾病以及惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等方面均發(fā)揮重要作用[4]?，F(xiàn)對lncRNAs在DCM的心臟發(fā)育和心肌纖維化方面的研究進(jìn)展予以綜述。

1 LncRNAs概述

在人類基因組30億個DNA堿基對中，5%～10%轉(zhuǎn)錄序列能被穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，但僅約2%的RNA有編碼蛋白質(zhì)功能，其他3%～8%的序列中大多數(shù)是非編碼RNA[5-7]。非編碼RNA可分為lncRNAs和調(diào)控RNA?，F(xiàn)已鑒定出27 919個人類lncRNAs基因及其表達(dá)譜，其中1 829個樣本來自主要的人類原始細(xì)胞和組織，且其中約70%的lncRNAs具有潛在功能[8]。LncRNAs是含200個以上核苷酸的內(nèi)源性RNA，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，以RNA形式在多個水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，但缺乏有效的開放讀碼框架，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[9-11]。

目前尚無統(tǒng)一的lncRNAs標(biāo)準(zhǔn)分類方法，根據(jù)lncRNAs基因組及其鄰近編碼區(qū)域的位置和相對方向，可將lncRNAs分為7類[12-13]：①正義lncRNAs，由包含外顯子的蛋白質(zhì)編碼基因的有義鏈轉(zhuǎn)錄。②反義lncRNAs，通過反義蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄形成，與相反鏈上的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物部分或完全互補(bǔ)。③內(nèi)含子區(qū)lncRNAs，由攔截基因序列的DNA序列轉(zhuǎn)錄，通過各種轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。④雙向lncRNAs，與蛋白質(zhì)編碼基因共享相同的啟動子，間隔大約1 kb，并以彼此相反方向轉(zhuǎn)錄。⑤基因間lncRNAs，是蛋白質(zhì)編碼基因間獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的序列。⑥增強(qiáng)子RNA，是蛋白質(zhì)編碼基因的增強(qiáng)子區(qū)產(chǎn)生。⑦環(huán)狀lncRNAs，通過剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成的共價閉合環(huán)狀RNA。

LncRNAs的主要作用機(jī)制包括：①指導(dǎo)lncRNAs與轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)相互作用，并將它們募集到基因靶標(biāo)或調(diào)節(jié)下游信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)的基因組位點(diǎn)。②誘導(dǎo)lncRNAs模仿并與其共有的DNA競爭結(jié)合核受體或細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)基因激活或沉默；還可以像“海綿”一樣[14]，吸附并帶走多種轉(zhuǎn)錄及修飾因子等，增加額外水平的轉(zhuǎn)錄組調(diào)節(jié)，以改變其效應(yīng)。③信號傳導(dǎo)lncRNAs與信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)，以響應(yīng)各種刺激，實(shí)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)。④支架lncRNAs作為一個中心平臺，許多蛋白質(zhì)復(fù)合物與特定基因組位點(diǎn)或靶基因啟動子結(jié)合，可選擇性地利用特定信號成分和輸出的重新定向和重塑細(xì)胞構(gòu)成具有轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活功能的復(fù)合體。

2 LncRNAs參與DCM發(fā)病的相關(guān)研究

2.1LncRNAs與心臟發(fā)育 lncRNAs的差異表達(dá)與心臟發(fā)育分化過程密切相關(guān)[15]。LncRNAs可與多個核酸形成復(fù)合物或作為共同激活劑通過直接干擾鄰近基因等方式調(diào)節(jié)心臟發(fā)育基因在轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳等層面的表達(dá)[16-17]。DCM發(fā)病與家族性遺傳或基因突變密切相關(guān)，心臟發(fā)育的生理過程受到時間和空間等因素的精細(xì)調(diào)控。研究表明，lncRNAs廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體的病理生理過程，在調(diào)控心臟發(fā)育與維持心肌功能方面具有重要作用[18-19]。

2.1.1LncRNA Braveheart(Bvht) Bvht是一種與小鼠心臟發(fā)育相關(guān)的lncRNA，它是胚胎由新生中胚層向心臟分化過程中所必需的RNA。Kiattenhoff等[20]發(fā)現(xiàn)，Bvht是激活心血管核心基因網(wǎng)絡(luò)的必需物質(zhì)，在心血管發(fā)育的中胚層相關(guān)蛋白1上游起作用，并證明了Bvht在心臟發(fā)育過程中具有誘導(dǎo)調(diào)節(jié)心臟核心基因激活的關(guān)鍵作用；該研究同時證實(shí)，Bvht在心肌細(xì)胞分化期間與多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的核心成分多梳蛋白Zeste基因抑制子12相互作用，表明Bvht介導(dǎo)了心臟的表觀遺傳調(diào)節(jié)。Xue等[21]測定Bvht二級結(jié)構(gòu)顯示，Bvht由12個螺旋、8個終端回路、5個較大的(>5 nts)內(nèi)部回路和5路結(jié)(5 WJ)組成，其可能包含3個外顯子[5′結(jié)構(gòu)域(H1～H2)、中央域(H3～H8)、3′結(jié)構(gòu)域(H9～H12)]，其中5′結(jié)構(gòu)域包含一個不對稱的富含G的內(nèi)部環(huán)結(jié)構(gòu)(AGIL)；進(jìn)一步研究表明Bvht AGIL可以與具有抑制心肌細(xì)胞分化功能的鋅指轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白相互作用，并證實(shí)細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白是Bvht的心血管譜系定向作用方式的關(guān)鍵組成部分，同時顯示Bvht和細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白可能通過控制G-四鏈體結(jié)構(gòu)共同調(diào)節(jié)心臟基因表達(dá)，與Bvht AGIL相互作用蛋白的功能成為未來研究的重點(diǎn)。然而，lncRNA Bvht在小鼠與人類基因組之間的保守性很低，目前并未發(fā)現(xiàn)兩者相同來源的基因，Bvht在DCM中調(diào)節(jié)心臟發(fā)育中的作用需要進(jìn)一步研究的闡明。

2.1.2LncRNA Fendrr Fendrr是一種長3 099 nt的lncRNA，定位于染色體3q13.31位點(diǎn)，包含4個外顯子。目前對Fendrr基因的研究多集中于腫瘤方面，其在心臟發(fā)育方面的相關(guān)研究較少。研究顯示，小鼠側(cè)向中胚層特異性Fendrr是小鼠的心臟和體壁發(fā)展的基礎(chǔ)，敲除小鼠胚胎Fendrr可上調(diào)控制側(cè)板或心臟中胚層分化的幾種轉(zhuǎn)錄因子，隨著PRC2的急劇減少以及組蛋白H3的第27位賴氨酸三甲基化的減少和(或)啟動子處組蛋白H3的第4位賴氨酸三甲基化的增加，F(xiàn)endrr與PRC2和TrxG/MLL復(fù)合物結(jié)合，互相作用并調(diào)節(jié)心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(GATA-6等)的表達(dá)，從而調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞的分化，表明Fendrr可作為心臟基因活性的染色體信號調(diào)節(jié)器而發(fā)揮作用[22]?？梢姡現(xiàn)endrr在心臟發(fā)育過程中具有重要作用，亦存在人類基因組中，但其在DCM心臟發(fā)育過程中作用尚缺少相關(guān)研究，需要進(jìn)一步探討研究。

2.1.3LncRNA CARMEN CARMEN是與活性心臟增強(qiáng)子和超級增強(qiáng)子相關(guān)的lncRNAs。Ounzain等[23]研究首次發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)子RNA與胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞期間的表達(dá)相關(guān)。進(jìn)一步的研究證實(shí)，CARMEN通過與PRC2兩種組分(Zeste基因抑制子12和Zeste基因增強(qiáng)子同源物2)的相互作用，起到了心臟內(nèi)環(huán)境平衡調(diào)節(jié)因子的關(guān)鍵作用；同時還證實(shí)，CARMEN組合式抑制心臟規(guī)格和心臟前體細(xì)胞的分化獨(dú)立于微RNA(microRNA，miRNA/miR)-143和miR-145的表達(dá)，兩種miRNA位于增強(qiáng)子序列的近端，CARMEN的表達(dá)在心臟病理重塑過程中被激活，是維持心肌細(xì)胞分化的必需物質(zhì)[24]。另有研究顯示，F(xiàn)endrr和CARMEN的表達(dá)水平與左心室質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)[25]。以上研究表明，CARMEN參與了心臟發(fā)育的調(diào)節(jié)，可能作為DCM病因診斷的生物標(biāo)志物。

2.1.4其他 在脊椎動物和人類心血管發(fā)育過程中，Alien、Punisher、Terminator是起差異性作用調(diào)節(jié)關(guān)鍵步驟的lncRNAs，分別在心血管祖細(xì)胞、分化的內(nèi)皮細(xì)胞中以及未分化的多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)；敲除其中任何一種均可導(dǎo)致胚胎期小鼠心血管發(fā)育不良，表明它們在心臟發(fā)育中起重要作用[26]。研究表明，三重域查找器(TDF)具有識別形成新型三鏈體lncRNA及其靶基因的能力，為lncRNA與心臟發(fā)育分化研究提供了新的工具，下調(diào)長鏈非編碼反義轉(zhuǎn)錄本(GATA6-AS)會損害GATA6的表達(dá)和心臟發(fā)育，GATA6-AS在人多能干細(xì)胞(hPSCs)分化成心肌細(xì)胞過程中具有調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的作用[27]。

2.2LncRNAs與心肌纖維化 心肌纖維化是以心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原纖維過量聚集及異常分布為特征的心肌間質(zhì)重塑。心肌纖維化主要包括6個途徑：①轉(zhuǎn)化生長因子-β1；②結(jié)締組織生長因子；③腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)；④炎癥因子；⑤縫隙連接蛋白；⑥基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。多項研究顯示，lncRNAs在心肌病中的作用多與調(diào)控心肌纖維化相關(guān)，而心肌纖維化是DCM的重要病理過程，常伴有心室增大、心律失常、心肌梗死及心力衰竭的發(fā)生，防止和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化對治療多種心臟疾病的意義重大，特別是DCM[4,28-29]。

2.2.1LncRNA MIAT MIAT位于染色體22q12.1位點(diǎn)，僅分布在細(xì)胞核中，其表達(dá)水平與心肌纖維化的程度明顯相關(guān)。Frade等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠纖維化模型中，心肌組織中的MIAT表達(dá)明顯增加；敲減MIAT質(zhì)粒后，其心肌組織的纖維化水平顯著下降，且相關(guān)纖維化調(diào)節(jié)因子及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，MIAT可通過序列互補(bǔ)性競爭內(nèi)源性RNA海綿樣作用吸收miR-24，而miR-24是轉(zhuǎn)化生長因子-β1激活因子，能促進(jìn)心肌纖維化的形成，MIAT表達(dá)增加會導(dǎo)致miR-24下調(diào)，最終導(dǎo)致心肌纖維化；該研究同時表明，MIAT是控制心肌纖維化并調(diào)節(jié)心肌梗死患者心臟功能的促纖維化因子，可被視為其他與纖維化相關(guān)的心臟病的治療目標(biāo)[31]。Zhou等[32]研究表明，MIAT可負(fù)調(diào)控miR-29a的表達(dá)，與肥厚型心肌病心肌纖維化的發(fā)展有關(guān)。

2.2.2LncRNA H19 H19是一種長度為2.3 kb的lncRNA，位于人類染色體端粒區(qū)11p15.5位點(diǎn)，屬于H19/IGF2印跡位點(diǎn)，該基因在胚胎的發(fā)育過程中呈高表達(dá)，出生后表達(dá)被抑制，與心肌、肺、肝的纖維化病變相關(guān)。Huang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌纖維化的過程中H19可通過吸附miR-455來調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子的表達(dá)。敲低H19水平可提高miR-455的抗纖維化作用，使結(jié)締組織生長因子的表達(dá)水平降低，進(jìn)一步減少Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等纖維化標(biāo)志基因的表達(dá)。Tao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，H19可通過負(fù)向調(diào)控雙特異性磷酸酶5基因的表達(dá)影響心肌纖維化；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，纖維化模型中的胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化水平升高，該過程受雙特異性磷酸酶5的調(diào)控，表明H19可通過抑制雙特異性磷酸酶5的表達(dá)促進(jìn)p-胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化的形成。

2.2.3LncRNA GAS5 GAS5是一種長度為630 nt的lncRNA，位于人類染色體1q25.1位點(diǎn)，可作為調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵因子，與心肌細(xì)胞凋亡和心室重塑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Tao等[34]研究顯示，GAS5過表達(dá)可抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖，并減少miR-21的表達(dá)。GAS5通過作用于miR-21調(diào)節(jié)人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的表達(dá)，以調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞增殖和心肌纖維化。Liu等[35]研究表明，GAS5在纖維化心肌中的表達(dá)顯著下調(diào)，注射pcDNA-GAS5可使過表達(dá)GAS5通過增加人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的表達(dá)來降低MMP-2、α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，從而減輕心肌纖維化程度，改善心功能。

2.2.4LncRNA MEG3 MEG3長度為35 kb，定位于人類染色體14q32.3位點(diǎn)，MEG3表達(dá)水平與心肌纖維化程度相關(guān)。Piccoli等[36]通過對主動脈縮窄與假手術(shù)小鼠的心肌成纖維細(xì)胞的全lncRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，心肌成纖維細(xì)胞中存在高表達(dá)且差異表達(dá)的MEG3；并通過體內(nèi)外實(shí)驗顯示，沉默心臟成纖維細(xì)胞中的MEG3基因可以抑制p53與MMP-2啟動子的結(jié)合，抑制心臟MMP-2的誘導(dǎo)表達(dá)，改善心臟纖維化和舒張性能。Zha等[37]研究發(fā)現(xiàn)，MEG3可在體內(nèi)外通過miR-181a/Egr-1/Toll樣受體4軸促進(jìn)纖維化和炎癥反應(yīng)。另有研究證實(shí)，MEG3過表達(dá)不僅可明顯抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，下調(diào)α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白α1鏈基因和蛋白的表達(dá)，還可減少纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。

2.2.5LncRNA TUG1 TUG1是由7 598個堿基組成的lncRNA，位于染色體22q12.2位點(diǎn)。有研究顯示，TUG1可參與多器官纖維化過程的調(diào)控，并與導(dǎo)致纖維化的相關(guān)蛋白有關(guān)[38]。Zhu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1表達(dá)與心肌纖維化程度呈正相關(guān)，但與脈搏氧飽和度呈負(fù)相關(guān)。隨著缺氧時間的延長，心肌成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物、Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA的表達(dá)增加。TUG1敲低改善了缺氧誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。miR-29c是心肌纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而TUG1的3′非翻譯區(qū)具有miR-29c結(jié)合位點(diǎn)，表明TUG1與miR-29c共同作用可能促進(jìn)心臟心肌成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的活化和慢性缺氧時的心肌纖維化。此外，慢性缺血性心肌病的發(fā)病過程亦與TUG1密切相關(guān)。Wu等[40]研究發(fā)現(xiàn)，TUG1與miR-145-5p結(jié)合可激活BNIP3蛋白的功能，進(jìn)而激活Wnt/β聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而介導(dǎo)慢性缺血性心肌病的發(fā)生與發(fā)展。Su等[41]研究表明，TUG1通過靶向miR-142-3p上調(diào)高遷移率族蛋白B1和Rac1蛋白的表達(dá)，在刺激缺血/缺氧心肌細(xì)胞自噬細(xì)胞凋亡中發(fā)揮核心作用，下調(diào)TUG1或上調(diào)miR-142-3p可改善心肌損傷和心肌纖維化。由此可見，lncRNA-TUG1與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其與DCM的關(guān)系以及是否能夠作為DCM預(yù)后判斷的預(yù)測因子尚未明確。

2.2.6其他 Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族(RAS association domain family，RASSF)1是Rassf抑癌家族的成員，在心臟成纖維細(xì)胞中，其亞型的主要剪接變體RASSF1A凋亡，對心臟肥大和纖維化具有保護(hù)作用。RASSF1-AS1是RASSF1基因的反義轉(zhuǎn)錄。Guo等[42]研究表明，野生型RASSF1-AS1對核因子κB活化和心肌纖維化具有促進(jìn)作用，但突變的RASSF1-AS1(結(jié)合區(qū)域被刪除)無上述作用；同時RASSF1-AS1抑制RASSF1A翻譯加劇了小鼠心肌纖維化，表明RASSF1-AS1可能是心肌纖維化的治療靶點(diǎn)。隨著lncRNAs研究的進(jìn)展與相關(guān)技術(shù)不斷的發(fā)展，Qu等[43]使用lncRNAs芯片技術(shù)篩選出多個在心肌纖維化組織中差異表達(dá)的lncRNAs，并使用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)隨機(jī)選擇9個上調(diào)的和5個下調(diào)的差異表達(dá)lncRNAs進(jìn)行驗證，通過基因本體論和途徑分析揭示了57個差異表達(dá)的lncRNAs和20對與心肌纖維化發(fā)展相關(guān)差異表達(dá)基因的lncRNAs信使RNA，首次在心肌纖維化的體內(nèi)模型中證明了lncRNAs具有調(diào)節(jié)心肌纖維化的潛力，揭示了失調(diào)lncRNAs可能參與了心肌纖維化及相關(guān)病理過程，并提供了多個可能調(diào)控心肌纖維化的lncRNAs，為DCM的心肌纖維化調(diào)控機(jī)制研究提供了新思路。

3 小 結(jié)

lncRNAs可以從不同層面參與調(diào)控DCM，但與蛋白編碼基因不同，lncRNAs無法通過序列推測其功能，且研究中存在較多難點(diǎn)，現(xiàn)有臨床研究數(shù)據(jù)極少，目前l(fā)ncRNAs在DCM乃至整個心血管領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，還存在許多認(rèn)識空白，且對于lncRNAs在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制及治療作用還有待進(jìn)一步研究。隨著生物信息學(xué)、高通量測序技術(shù)及基因芯片等技術(shù)的不斷發(fā)展，lncRNAs基因數(shù)據(jù)庫將不斷得到完善，新的數(shù)據(jù)分析方法亦能夠不斷被應(yīng)用，將有助于lncRNAs的深入研究，并為DCM潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究提供幫助，為人類認(rèn)識和診治心血管疾病提供更確切可靠的證據(jù)。