膠質(zhì)母細(xì)胞瘤替莫唑胺耐藥機制的研究進展

楊國榮，封林奇，顧錦濤，賈博，穆楠

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員一大隊，西安 710032； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室藥學(xué)院生物制藥學(xué)教研室，西安 710032； 3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安 710032；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)教研室，西安 710032)

腦膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤和混合性膠質(zhì)瘤4種類型，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中級別最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的成人顱內(nèi)惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織分級達(dá)到Ⅳ級[1]。GBM呈浸潤性生長，常侵犯周圍正常組織，手術(shù)完全切除非常困難，復(fù)發(fā)率高[2]。目前，臨床對于GBM的治療普遍采用最大安全范圍手術(shù)切除、替莫唑胺(temozolomide，TMZ)化療及輔助性放療相結(jié)合的方案，但患者的中位生存期仍無明顯延長[3]，且GBM患者相較于其他類型的膠質(zhì)瘤患者更易對TMZ產(chǎn)生耐藥[4-5]。因此，如何減少GBM患者的TMZ耐藥作用，提高GBM患者的化療敏感性，降低患者腫瘤的復(fù)發(fā)率，是GBM臨床治療急待解決的問題?，F(xiàn)有的研究顯示，DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞自噬和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)等途徑廣泛參與GBM發(fā)生、發(fā)展的腫瘤生物學(xué)進程，并直接介導(dǎo)了TMZ耐藥產(chǎn)生[6-7]?，F(xiàn)就GBM TMZ耐藥機制的研究進展予以綜述。

1 DNA損傷修復(fù)與TMZ耐藥

TMZ屬于烷化劑，口服生物利用度近乎100%，且易透過血腦屏障，為目前治療GBM的一線化療藥物。TMZ進入腫瘤細(xì)胞后其分解產(chǎn)物可導(dǎo)致DNA的甲基化，進而干擾細(xì)胞的DNA復(fù)制，造成DNA損傷，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。但是在GBM細(xì)胞中存在極強的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)和復(fù)雜的損傷修復(fù)機制，這些修復(fù)機制是介導(dǎo)GBM對TMZ產(chǎn)生耐藥的重要原因。目前認(rèn)為，TMZ耐藥是 O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methyl-guanine-DNA-methytransferase，MGMT)、錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)等DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)以及自噬、腫瘤干細(xì)胞等共同作用的結(jié)果[8]。而在GBM的DNA損傷修復(fù)方面，新近的研究主要集中于MGMT、MMR以及一些具有調(diào)控DNA損傷修復(fù)功能的基因方面。

1.1MGMT介導(dǎo)的GMB耐藥 MGMT的主要作用是在TMZ造成腫瘤細(xì)胞DNA損傷之前逆轉(zhuǎn)TMZ對DNA的甲基化作用，它可以直接從鳥嘌呤O6的位置上去除烷基基團，導(dǎo)致TMZ治療失效，而GMB細(xì)胞中MGMT表達(dá)相對穩(wěn)定且較其他類型膠質(zhì)瘤高[9]。因此，闡明調(diào)控MGMT的關(guān)鍵分子和信號通路，成為TMZ耐藥領(lǐng)域的研究熱點。

1.1.1MGMT陽性GBM與TMZ耐藥 MGMT啟動子甲基化與MGMT基因的表達(dá)密切相關(guān)，MGMT啟動子甲基化后可直接抑制MGMT基因的轉(zhuǎn)錄。Tezcan等[10]發(fā)現(xiàn)，歐油菜葉提取物通過促進MGMT啟動子甲基化，協(xié)同增加了GBM的TMZ反應(yīng)，提高了TMZ敏感性；此外，歐油菜葉提取物還可能通過下調(diào)p53抑制GBM細(xì)胞，從而將TMZ的作用機制從典型的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ罹€粒體死亡通路或壞死。

此外，Yang等[11]發(fā)現(xiàn)，沉默特異AT序列結(jié)合蛋白1基因也可以引起MGMT表達(dá)的下調(diào)和SLC22A18表達(dá)的上調(diào)，從而緩解GBM的TMZ耐藥，提示特異AT序列結(jié)合蛋白1基因?qū)GMT介導(dǎo)的TMZ耐藥具有重要意義。然而，MGMT啟動子甲基化有時與MGMT表達(dá)水平并不一致，提示可能有新的基因表達(dá)調(diào)控機制存在。如Chen等[12]報道了一個名為“K-M增強子”的增強子，它是一個具有調(diào)節(jié)MGMT表達(dá)功能的遠(yuǎn)端增強子，K-M增強子的激活可以“繞過”MGMT啟動子甲基化，激活MGMT的轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋部分GMB細(xì)胞中MGMT啟動子甲基化與其表達(dá)水平不一致的情況，還可以解釋部分MGMT啟動子甲基化較高的GMB患者預(yù)后仍較差的問題。因此，MGMT基因的表達(dá)調(diào)控不僅僅依賴于啟動子甲基化修飾這一表觀遺傳學(xué)水平，一些基于MGMT基因的轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平的調(diào)控機制研究將有助于更好地回答MGMT基因?qū)MZ治療的影響。

1.1.2MGMT陰性GBM與TMZ耐藥 具有MGMT表達(dá)的GBM患者對TMZ治療具有先天的耐藥性，但MGMT基因缺陷的GBM患者也不一定對TMZ敏感。Yi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過持續(xù)的TMZ治療后，大多數(shù)最初對TMZ敏感的MGMT陰性GBM患者也會產(chǎn)生TMZ耐藥；進一步研究發(fā)現(xiàn)，脫氫膽甾醇2(dehydrocholesterol 2，DHC2)的表達(dá)是MGMT缺陷細(xì)胞獲得TMZ耐藥性的關(guān)鍵調(diào)控分子，而且在復(fù)發(fā)性MGMT缺陷的TMZ抵抗性GBM患者的腫瘤組織中DHC2表達(dá)顯著增強。其機制主要是持續(xù)的TMZ治療誘導(dǎo)了GBM的細(xì)胞骨架重排，繼而誘發(fā)DHC2的表達(dá)；抑制DHC2的表達(dá)可以增強TMZ誘導(dǎo)的DNA損傷，提高MGMT陰性的GBM細(xì)胞對TMZ的敏感性，但該調(diào)控通路在MGMT陽性患者的GBM細(xì)胞中并不顯著[14]。此外，脫氫表雄酮可通過降低MGMT陰性GBM細(xì)胞的DNA損傷阻止TMZ誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，其主要機制是脫氫表雄酮激活LYN-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)級聯(lián)反應(yīng)，促進Sp1(specificity protein 1)磷酸化，磷酸化的Sp1定位于TMZ損傷的DNA，進而阻止了進一步的DNA損傷，同時磷酸化的Sp1還能募集組蛋白去乙?；竵硗瓿扇ヒ阴；?，去乙?；腟p1可以招募增殖細(xì)胞核抗原來減弱DNA損傷，降低TMZ的毒性[15]。

1.2MMR介導(dǎo)的TMZ耐藥 MMR作為DNA修復(fù)機制的一種，發(fā)生在DNA損傷后。MMR可以拮抗TMZ對GBM細(xì)胞的損傷作用，修復(fù)發(fā)生損傷的DNA，導(dǎo)致GBM對TMZ的敏感性降低。新近的研究發(fā)現(xiàn)，在進行DNA損傷修復(fù)的過程中存在不成功的MMR，這種不成功的MMR發(fā)揮與MMR截然相反的作用[16]。在TMZ的甲基化靶點中，DNA的鳥嘌呤O6是極為關(guān)鍵的一個，鳥嘌呤的甲基化可以引起堿基錯配，而在DNA復(fù)制時不成功的MMR可將新合成鏈中錯配的胸腺嘧啶(O6-甲基鳥嘌呤-胸腺嘧啶)識別并切除，從而導(dǎo)致DNA雙鏈缺口形成，隨著DNA復(fù)制的進行DNA損傷不斷積累，引起細(xì)胞周期停滯，啟動細(xì)胞的凋亡，以此來增加TMZ的敏感性；而MMR的功能缺失會導(dǎo)致錯配修復(fù)無法進行，若O6-甲基鳥嘌呤-胸腺嘧啶的錯配一直存在，則會引起更多的堿基錯配，最終導(dǎo)致基因突變，GBM的進展加快，使得腫瘤細(xì)胞對TMZ產(chǎn)生耐藥[17]。因此，無論是不成功的MMR還是MMR缺陷都使得GBM對TMZ治療產(chǎn)生耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，對于MMR缺陷所致的TMZ耐藥的GBM，通過提高極樣激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)的表達(dá)可以抑制其生長[18]。另外，Stritzelberger等[16]發(fā)現(xiàn)，洛莫司汀也可克服由MMR缺陷所引起的TMZ耐藥，另外，當(dāng)過量的O6-甲基鳥嘌呤導(dǎo)致MGMT飽和時，錯配的堿基也會觸發(fā)這種重復(fù)但不成功的MMR，進而誘導(dǎo)凋亡。而相較于MMR，BER是修復(fù)DNA堿基損傷的主要DNA修復(fù)途徑，有研究發(fā)現(xiàn)，激活的C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白8-松弛素/胰島素樣肽受體1-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路可以促進GBM細(xì)胞的BER，并導(dǎo)致對TMZ的耐藥[19]。

1.3調(diào)控DNA修復(fù)的基因 TMZ引起的DNA甲基化并不能直接觸發(fā)GBM細(xì)胞的死亡，它需要在甲基化后通過DNA復(fù)制和MMR來積累DNA損傷，最終導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的形成，而在此過程中X線修復(fù)交叉互補基因3(X-ray repair cross complementing gene 3，XRCC3)起關(guān)鍵調(diào)控作用。在生理情況下，XRCC3對于維持基因組完整性和細(xì)胞的存活至關(guān)重要，而在高級別的膠質(zhì)瘤中XRCC3表達(dá)水平升高，過表達(dá)的XRCC3可通過同源重組促進雙鏈斷裂的修復(fù)，繼而保護GBM細(xì)胞免受TMZ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、凋亡和細(xì)胞周期抑制，直接參與TMZ耐藥的形成；XRCC3剔除后，TMZ引起的雙鏈斷裂修復(fù)概率顯著降低，GBM對TMZ的敏感性大幅提升[20]。此外，α-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征(α-thalassemia mental retardation syndrome X-linked,ATRX)基因也可通過調(diào)節(jié)DNA的損傷修復(fù)來參與GBM的TMZ耐藥，ATRX基因剔除可抑制DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)，進而抑制GBM的生長和侵襲，增加TMZ治療的敏感性[21]。因此，ATRX基因的表達(dá)也是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后更好、生存時間更長的標(biāo)志。ATRX基因發(fā)揮作用的具體機制是：ATRX表達(dá)的抑制導(dǎo)致36位賴氨酸位點的三甲基化修飾的組蛋白H3(H3K36me3)降低，而H3KPme3是毛細(xì)血管擴張性共濟失調(diào)突變(ataxia telangiectasia mutated，ATM)信號通路的重要參與者，H3KPme3的減少降低了ATM的乙?；瑢?dǎo)致TMZ誘導(dǎo)的ATM信號通路的激活受到抑制，而ATM信號通路又是重要的DNA修復(fù)機制，其抑制使DNA修復(fù)減少，TMZ對細(xì)胞的殺傷效果增強；反之，ATRX基因表達(dá)的升高可以增強ATM信號通路的激活，導(dǎo)致TMZ耐藥的發(fā)生[21]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45A(growth arrest and DNA damage inducible protein 45A，GADD45A)作為一種應(yīng)激蛋白，在TMZ作用于GBM時通過促進DNA的修復(fù)保護了GBM細(xì)胞，導(dǎo)致TMZ耐藥的形成；細(xì)胞暴露于基因毒性環(huán)境中時，GADD45A被激活，導(dǎo)致G2/M細(xì)胞周期檢查點的執(zhí)行，從而為DNA修復(fù)提供時間，活化的GADD45A通過與增殖細(xì)胞核抗原和脫嘌呤嘧啶核酸內(nèi)切酶相互作用促進DNA的損傷修復(fù)，導(dǎo)致TMZ耐藥的發(fā)生，其具體機制可能與p53通路有關(guān)[22]。

2 腫瘤細(xì)胞自噬與TMZ耐藥

2.1細(xì)胞自噬概述 細(xì)胞自噬是降解受損或退化的細(xì)胞器或受損蛋白質(zhì)的一種亞細(xì)胞過程，是細(xì)胞應(yīng)對不良外界環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[23]。細(xì)胞自身可以利用降解所產(chǎn)生的物質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝的平衡，其次這種溶酶體介導(dǎo)的反應(yīng)也可以將受損細(xì)胞降解以維持其他正常細(xì)胞的存活[24]。目前大量研究證實，自噬可能是腫瘤細(xì)胞面對治療壓力時的促生存反應(yīng)，自噬可通過促進腫瘤細(xì)胞的密集增殖幫助腫瘤細(xì)胞抵御多種不利的環(huán)境因素(如化療藥物、放射線等)，從而使腫瘤細(xì)胞在某些治療中存活[25]。但是過度的自噬則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，稱為自噬性細(xì)胞死亡或Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[23]，因而抑制細(xì)胞自噬可以降低這種形式的細(xì)胞死亡。

2.2自噬與TMZ耐藥 關(guān)于自噬在GBM的TMZ耐藥中發(fā)揮的作用目前仍不明確，對于自噬與TMZ耐藥的關(guān)系也一直存在很大爭議。少部分的報道認(rèn)為，誘導(dǎo)自噬可以提高TMZ的細(xì)胞毒性，而抑制自噬則會降低療效；但大部分部分觀點認(rèn)為，抑制自噬可以增加TMZ化療的敏感性，如白藜蘆醇在TMZ治療GBM中所發(fā)揮的協(xié)同效應(yīng)是通過抑制自噬而產(chǎn)生的[23]。在Vu等[24]的研究利用CRISPR/Cas9將GBM的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬小體所必需的自噬相關(guān)蛋白5基因剔除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種剔除只對自噬產(chǎn)生抑制作用，并未改變腫瘤細(xì)胞對TMZ的敏感性，同時也未發(fā)現(xiàn)TMZ可以誘導(dǎo)自噬。而有研究指出，TMZ可以通過誘導(dǎo)自噬性死亡殺傷GBM腫瘤細(xì)胞[23]，Vu等[24]推測這種結(jié)果可能是腫瘤細(xì)胞變異所導(dǎo)致的。

另有研究表明，抑制GBM腫瘤細(xì)胞線粒體自噬后可以提高TMZ敏感性，增強TMZ的細(xì)胞毒性[26]。Lohitesh等[27]發(fā)現(xiàn)，TMZ誘導(dǎo)的自噬使GBM細(xì)胞中保護性ATP大量增加，這種變化有利于腫瘤細(xì)胞抵抗TMZ的毒性作用，而促進耐藥的形成。這也從側(cè)面說明抑制GBM自噬的發(fā)生可以抑制耐藥的形成。Filippi-Chiela等[28]的研究發(fā)現(xiàn)TMZ對GBM細(xì)胞造成的急性DNA損傷激活了AMP活化的蛋白激酶催化亞基/AMP活化的蛋白激酶-unc-51樣激酶1和促分裂原活化的蛋白激酶14通路，并持續(xù)下調(diào)Akt-磷脂酰肌醇-3-激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路，導(dǎo)致自噬的活化；自噬與衰老標(biāo)志物的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，在DNA損傷前通過抑制mTOR可以促進細(xì)胞衰老，在損傷后可以通過抑制自噬進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高TMZ的敏感性，更多地殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，某些藥物可以通過抑制自噬而對TMZ產(chǎn)生特異性增敏作用，如Thioridazine，它抑制自噬后可以抑制與TMZ耐藥相關(guān)代謝通路的改變，而使GBM對TMZ的作用更敏感[29]。綜上，雖然自噬在GBM的TMZ耐藥過程中發(fā)揮了重要作用，但具體機制仍需要進一步的研究，為解決GBM的TMZ耐藥性難題提供新的視角。

3 GSCs與TMZ耐藥

3.1GSCs概況 GSCs是膠質(zhì)瘤組織中存在的極少具有“干細(xì)胞特征”的細(xì)胞亞群，具有自我更新、不斷增殖等特性[30]。1992年，Reynolds等[31]首次提出，包括人在內(nèi)的哺乳動物的膠質(zhì)瘤中存在GSCs，隨后被眾多研究者證實。有學(xué)者報道，因膠質(zhì)瘤病理類型和級別的不同，GSCs所占比例為0.3%～9.1%[32]。Kondo等[33]報道，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中GSCs約占0.4%。還有研究發(fā)現(xiàn)，多形性GBM中GSCs所占的比例為0.5%～3%，而髓母細(xì)胞瘤中這一比例為0.5%～0.8%[34]。以上研究表明，GSCs的比例與腫瘤的病理類型和惡性程度密切相關(guān)，且各類型中GSCs所占比例存在較大的差異。目前認(rèn)為，GSCs樣細(xì)胞是GBM的起源細(xì)胞之一，是GBM極為容易復(fù)發(fā)的重要原因，也是GBM對放化療產(chǎn)生耐受的主要根源，在GBM發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

3.2GSCs與TMZ耐藥 對于GSCs與GBM耐藥性的關(guān)系，學(xué)界普遍認(rèn)為，GSCs的存在使GBM細(xì)胞對TMZ等藥物治療產(chǎn)生了耐藥性，從而導(dǎo)致治療效果不佳，但其中的機制還有待進一步闡明[35]。Auffinger等[30]認(rèn)為，在經(jīng)過TMZ等化療藥物的治療后，膠質(zhì)瘤內(nèi)部分腫瘤細(xì)胞會轉(zhuǎn)化為GSCs，而這一類細(xì)胞會體現(xiàn)出對化療藥物更強的耐藥性，影響治療效果。而Gong等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，TMZ雖然可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞死亡，但是對GSCs的作用較小，而這種作用與多重耐藥的ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白G2基因的表達(dá)相關(guān)；另外，在對ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族的研究中發(fā)現(xiàn)，這一類蛋白可以幫助腫瘤細(xì)胞將TMZ泵出細(xì)胞，從而產(chǎn)生耐藥性。ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員中的ABCB1、ABCC1和ABCG2在CD133+細(xì)胞亞群中明顯高表達(dá)，提示其可能是GSCs耐藥性產(chǎn)生的一個重要機制[37]。Yu等[38]的研究聯(lián)合使用二甲雙胍和TMZ處理GSCs后發(fā)現(xiàn)，GSCs自我更新能力降低，同時對TMZ的敏感性增加，而Akt-mTOR通路活性的下調(diào)則部分解釋了其中的機制。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，GSCs容易向腫瘤周邊的腦組織遷移和侵襲，手術(shù)并不能將這些侵入腫瘤周邊的GSCs全部清除，即使術(shù)后輔助放、化療等，最終仍難以將其全部殺滅，GSCs因此成為膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的“種子”細(xì)胞[39]。除上述因素外，前文提到的MGMT同樣在GSCs的TMZ耐藥性形成中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MGMT在CD133+細(xì)胞中高表達(dá)，而MGMT啟動子甲基化狀態(tài)在未分化和參與分化的GSCs中對TMZ的敏感性表現(xiàn)出很大的差異，說明MGMT可能通過某種機制參與了GSCs耐藥性的產(chǎn)生[40]。此外，HH(Hedgehog)/Gli1信號通路也參與這一過程，GSCs異常激活了HH/Gli1信號通路，環(huán)巴胺對該信號通路抑制后可以顯著降低MGMT的表達(dá)[41]，表明在GSCs水平上確實存在HH/Gli1信號通路的調(diào)控機制，該信號通路可以調(diào)控GSCs中MGMT的表達(dá)和TMZ耐藥，這為解決GSCs的TMZ耐藥和GBM高復(fù)發(fā)率提供了一個新的研究方向。

4 小 結(jié)

GBM是腦膠質(zhì)瘤中惡性程度最高、最具侵襲性的一種，且極易復(fù)發(fā)，長期存活率極低，目前只能以手術(shù)切除，再輔以放化療。而GBM對一線化療藥物TMZ易產(chǎn)生耐藥，除了一部分先天對TMZ不敏感的腫瘤細(xì)胞，一些原本敏感的腫瘤細(xì)胞也會在化療過程中逐漸發(fā)生獲得性耐藥，這極大地影響術(shù)后化療的效果。在獲得性耐藥形成的過程中DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞自噬、腫瘤干細(xì)胞等都發(fā)揮重要的作用。目前的研究雖然揭示了GBM治療過程中TMZ耐藥形成的許多調(diào)控過程，但還有更多的問題尚未解決。近年來單細(xì)胞組學(xué)、高通量蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多重組學(xué)研究的發(fā)展，將為TMZ耐藥機制的系統(tǒng)闡明提供極為有利的幫助。