YAP介導的力學信號轉導在血管生成中的研究進展

鮑遠，聶銘博，施佳，李孟偉，康皓

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院骨科,武漢 430030)

隨著組織工程技術的興起，利用人工支架修復皮膚軟組織缺損的研究越來越廣泛，并且部分支架已經(jīng)應用于臨床。然而單純的支架移植并不能取得良好的臨床效果，其中一個重要原因是植入體內的支架中難以形成血管。因此，如何將正常結構的血管網(wǎng)絡整合到人工支架中是組織工程領域的一個重要挑戰(zhàn)。為了解決這一問題，在支架中接種血管生成細胞(干細胞或祖細胞)成為一種較常見的預處理方式[1]。除了過去研究最廣泛的生物化學因素，近年來發(fā)現(xiàn)機械力在血管生成中也起重要作用[2]。力學因素能夠影響內皮細胞的增殖分化、功能行為以及形成血管網(wǎng)絡結構的能力，因此人工支架的微結構和機械力學性能對其中的內皮細胞形成血管具有重要影響[3]。

細胞從感知外環(huán)境中的力學刺激到發(fā)生基因轉錄水平的變化稱為力學信號轉導。力學信號轉導能使細胞感知外界力學刺激信號并對其做出應答，該過程涉及肌動蛋白細胞骨架的快速重構并激活特定基因，從而調控細胞的增殖、分化、遷移等生物學行為[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)受多種機械力學的調控，同時也是力學信號轉導過程中的關鍵環(huán)節(jié)[5-6]?，F(xiàn)對YAP介導的力學信號轉導在調控血管再生中的作用和機制進行歸納和總結。

1 Hippo信號通路及其效應因子YAP

YAP與c-Yes酪氨酸激酶作用相關，因而被命名為Yes相關蛋白[7]。YAP作為一種協(xié)同轉錄因子，必須與轉錄因子結合才能促進相關基因的轉錄。其結構中含有WW結構域和TEAD結合區(qū)域，能識別并結合多種轉錄因子。其中，有關轉錄因子復合體YAP-TEAD所介導的生物學功能研究報道較多，研究認為TEAD是介導YAP功能的關鍵轉錄因子[8]。如果YAP或TEAD基因發(fā)生突變導致兩者無法結合，則會顯著抑制細胞增殖和組織生長[8]。YAP是位于人類染色體11q22上的擴增子，在人體很多癌癥中可以發(fā)現(xiàn)YAP的表達異常增多，尤其在肝癌中[9]。在小鼠肝細胞內過表達YAP會導致肝臟體積增大以及腫瘤的發(fā)生，提示YAP在器官發(fā)育調控和腫瘤發(fā)生方面起重要作用[10]。

YAP是Hippo通路的直接效應因子。YAP活化后能夠促進細胞增殖、組織器官生長以及細胞癌變，而Hippo通路通過抑制YAP活性調控組織細胞增殖和器官體積[11]。如小鼠的肝臟被切除2/3后，剩余肝臟再生到正常體積時就會停止生長；此外，在體外培養(yǎng)時，細胞與鄰近其他細胞的接觸會導致其增殖受到抑制[12]。在哺乳動物中Hippo通路的核心成員包括哺乳動物STE20相關蛋白激酶(mammalian STE20-like protein kinase，MST)1/2、Salvador同源物1(Salvador homolog 1，SAV1)、大腫瘤抑制因子同源物(large tumor suppressor homologue，LATS)1/2和MOB激酶激活因子1(MOB kinase activator 1，MOB1)。MST1/2和LATS1/2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它們相繼發(fā)生磷酸化后形成激酶級聯(lián)反應，從而激活Hippo通路。SAV1和MOB1是支架蛋白，前者為MST1/2和LATS1/2的作用提供結構支持；后者能被MST1/2磷酸化，磷酸化后的MOB1結合LATS1/2的能力增強，從而增加LAT1/2激酶的活性。沉默SAV1或降低MOB1的磷酸化水平均能抑制Hippo通路的活性，因此SAV1-MST1/2或MOB1-LATS1/2復合體的完整性是Hippo信號通路發(fā)揮功能的結構基礎。Hippo通路激活后，活化的LATS1/2將YAP磷酸化。磷酸化的YAP在胞質中與14-3-3蛋白結合，其活性因此被抑制。相反，當Hippo通路被抑制，YAP去磷酸化并進入細胞核，與轉錄因子TEAD1-4結合從而啟動目的基因的轉錄[11]。組織再生過程涉及組織來源干細胞的增殖、遷移、分化等過程，組織損傷后Hippo-YAP信號通路動員干細胞，并調控其增殖、遷移、分化等生物學行為，在組織損傷修復過程中具有重要作用[13]。

2 力學信號轉導

2.1肌動蛋白細胞骨架在力學信號轉導中的作用 在細胞增殖、分化、遷移以及干細胞特性維持的過程中，細胞間接觸、細胞外基質硬度、流體剪切力等力學信號無處不在，并發(fā)揮重要調控作用[14-16]。細胞表面整合素受體形成的黏附斑是細胞感知力學信號的重要結構。通過該結構細胞能夠感知來自相鄰細胞、細胞外基質和黏附位點的機械應力，并通過調節(jié)細胞骨架的結構和張力來適應細胞外的力學環(huán)境，從而維持細胞的形態(tài)并調控增殖、分化、凋亡、遷移等生物學行為[17]。絲狀肌動蛋白(fibrous actin,F-actin)是構成細胞骨架的重要成分，它是由單體的球形肌動蛋白(globular actin,G-actin)聚合而成。肌動蛋白細胞骨架形成后處于解聚與合成的動態(tài)平衡中，并受多種因素的調節(jié)，從而能夠對力學刺激作出迅速的應答[18]。細胞處于硬度較大的細胞外基質中，F(xiàn)-actin合成增多并形成應力纖維，且細胞伸展出細長的絲狀偽足；相反，細胞在硬度較小的細胞外基質中，F(xiàn)-actin發(fā)生解聚形成單體的G-actin，且細胞縮小呈圓形[19]。肌動蛋白細胞骨架處于解聚與合成的動態(tài)平衡中并受到Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming kinase,ROCK)信號通路的調控。ROCK被GTP-RhoA激活后，導致肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化而被激活，活化的MLC促進肌動蛋白細胞骨架收縮，增加細胞張力，從而使細胞伸展。除直接磷酸化MLC，ROCK還可以通過磷酸化MLC磷酸酶的調節(jié)亞基肌球蛋白磷酸酶靶向亞單位1來抑制MLC磷酸酶活性,從而間接增加MLC的磷酸化水平。此外，ROCK能激活LIM激酶，后者使絲切蛋白磷酸化并抑制其對細胞骨架的解聚作用，從而促進肌動蛋白細胞骨架的形成[20]。用抑制劑Y-27632抑制ROCK或拉春庫林B直接解聚F-actin會導致細胞處于低張力狀態(tài)，此時細胞的增殖、遷移等生物學行為不再受到外界機械力刺激的影響[19]。上述實驗證實肌動蛋白細胞骨架的結構和動力學改變在力學信號轉導過程中發(fā)揮重要作用。

2.2YAP在力學信號轉導中的作用 Hippo-YAP通路上游的調控因素非常廣泛，除多種生物化學信號外，還包括細胞外基質硬度、細胞間或細胞與基質的黏附、細胞密度、細胞形態(tài)等機械力學信號。這些上游的機械刺激均會引起肌動蛋白細胞骨架結構和動力學的改變[21]。在肌動蛋白細胞骨架介導的力學信號轉導過程中YAP發(fā)揮關鍵的作用[22]。機械力學信號能影響YAP的磷酸化水平，細胞在硬度較大的細胞外基質上生長時，YAP發(fā)生去磷酸化并進入細胞核，從而啟動目的基因的轉錄；相反，細胞在硬度較小的細胞外基質上生長時，YAP發(fā)生磷酸化并滯留在胞質中，相關基因的表達被抑制[19]。為了進一步確定機械力調控YAP的機制，研究者將細胞接種至不同面積的纖連蛋白涂層上，涂層面積的大小決定細胞黏附后的伸展面積。研究發(fā)現(xiàn)，在面積較大的纖連蛋白涂層上，細胞充分伸展，YAP被激活；而在面積較小的纖連蛋白涂層上，YAP的活性被抑制。改變基質的硬度后再重復上述實驗仍能得到相同的結果[19]。該研究認為細胞的形態(tài)和大小能調控YAP的活性，而其機制可能與細胞中F-actin的數(shù)量有關。體積較大的細胞內有更多的F-actin形成，從而導致YAP被激活。用拉春庫林B解聚F-actin則會導致YAP的磷酸化水平升高而失活。因此，F(xiàn)-actin通過對YAP活性的調控將外部的機械力學刺激轉化為生物化學信號，從而調控相關基因的轉錄活性[19]。在不同的發(fā)育階段和組織類型中，F(xiàn)-actin通過調控YAP活性影響細胞的生物學行為。如在果蠅三齡幼蟲的翅成蟲盤中，加帽蛋白的功能缺陷或形成蛋白同源物Dia過表達會導致F-actin合成增多，從而促進細胞增殖和組織過度生長[21,23]。此外，基質硬度、細胞形態(tài)、張應力等機械力刺激通過肌動蛋白細胞骨架對YAP活性的調控能誘導間充質干細胞向特定細胞系的分化[19]。因此，YAP在力學信號轉導過程中發(fā)揮關鍵的作用。

3 力學信號轉導在血管生成中的作用

血管形成過程是一個復雜和多步驟的過程，伴隨著血管內皮細胞的增殖、遷移和生存。該過程受多種生長因子的調控，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是主要的驅動因素，其對血管功能的影響是目前研究的熱點[24]。在血管內皮細胞中，VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)主要有VEGFR1和VEGFR2。VEGFR2與VEGF結合時發(fā)生自磷酸化并被激活，通過一系列下游信號的轉導，最終促進內皮細胞增殖、遷移和血管生成[25]。VEGF與VEGFR2結合后引起的細胞內信號通路的變化已被廣泛研究，但VEGF信號傳遞到細胞核內并啟動相關基因轉錄程序的機制以及這些基因轉錄的具體作用仍不清楚[26]。

在皮膚組織工程的研究中，VEGF被加入人工支架中以促進血管的形成[3,26]。然而在部分支架中，加入VEGF的內皮細胞也無法形成正常而穩(wěn)定的血管結構。研究發(fā)現(xiàn)，YAP是血管形成過程中必不可少的因子，并且在此過程中VEGF能激活YAP的協(xié)同轉錄功能[26]。敲除小鼠體內VEGF基因會使胚胎和卵黃囊的血管嚴重畸形，從而導致胚胎死亡[24]。此外，敲除YAP基因后，卵黃囊內也出現(xiàn)明顯的血管缺陷，并導致胚胎發(fā)育停滯[27]。VEGF能夠誘導內皮細胞中結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)和富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,CYR61)的表達，同時也是YAP的靶基因[28]。轉錄因子TEAD1-4能與協(xié)同轉錄因子YAP結合并啟動相關基因的表達，有研究證實TEAD4是VEGF誘導內皮細胞成血管過程中所必需的轉錄因子[29]。研究顯示，在新生血管前端的內皮細胞中，YAP表達量豐富且定位于細胞核，表明血管生成過程中伴隨著YAP的大量激活。此外，在處于發(fā)育階段的動物體內沉默YAP基因會導致視網(wǎng)膜血管發(fā)育障礙[28,30]。這些研究均提示YAP參與血管生成的過程，而且VEGF能調控YAP的活性。在體外實驗中，用VEGF刺激內皮細胞可以發(fā)現(xiàn)YAP去磷酸化并進入細胞核，同時YAP的靶基因CTGF和CYR61的表達明顯上調。沉默YAP基因后，通過劃痕實驗和成管實驗證實內皮細胞的遷移能力和血管形成能力明顯下降，而且VEGF不再增強內皮細胞的遷移能力和血管形成能力，同時VEGF也不再促進CTGF和CYR61的表達。此外，阻斷VEGFR2能抑制VEGF誘導的YAP去磷酸化的作用[26]。上述研究證實了VEGF作用于VEGFR2后通過激活YAP來啟動血管生成的過程。

在血管生成的過程中，內皮細胞從激活、增殖到新生血管形成，除多種化學信號參與外，還涉及力學信號的轉導過程，力學信號是調控血管內皮細胞黏附、遷移、血管生成等生物學行為的重要因素[4]。研究已證實，VEGF能夠調控肌動蛋白細胞骨架重構并促進內皮細胞遷移[31]。完整的細胞骨架對于VEGF誘導YAP活化是必需的。用拉春庫林B解聚F-actin能夠提高YAP的磷酸化水平并使其停留在細胞質內而失去轉錄活性[30]。VEGF能誘導YAP去磷酸化并進入細胞核啟動靶基因的轉錄，而在拉春庫林B存在的情況下VEGF則會失去這一作用[26]。因此，VEGF誘導YAP活化與肌動蛋白細胞骨架重構有關。Src家族激酶是已知的VEGF-VEGFR2下游的信號分子，能夠調控VEGF介導的肌動蛋白細胞骨架重構，從而促進內皮細胞遷移和血管的侵襲[32]。用Src家族激酶的特異性抑制劑PP2抑制其活性，能阻斷VEGF引起的YAP去磷酸化、核內定位以及其靶基因的表達。RhoA激活ROCK信號通路后能夠促進肌動蛋白細胞骨架合成并形成應力纖維，從而降低YAP的磷酸化水平并促進其進入細胞核內啟動相關基因轉錄[33]。然而，用RhoA的特異性抑制劑C3抑制其活性后ROCK激酶活性被抑制，此時VEGF不再對YAP的磷酸化和亞細胞定位產(chǎn)生影響。這些研究進一步證實了VEGF通過肌動蛋白細胞骨架的重構來調控YAP的活性。YAP是Hippo信號通路的直接效應因子，研究證實VEGF能降低LATS1的磷酸化水平，提示VEGF調控YAP的活性需要Hippo和肌動蛋白細胞骨架的參與[26]。綜上所述，VEGF啟動的血管生成過程與力學信號轉導有關。

4 小 結

隨著對生物力學研究的不斷深入，力學信號轉導在調控細胞增殖、分化、遷移等方面的重要作用逐漸被認識到，尤其在組織工程研究領域。在血管再生過程中，血管內皮細胞感知環(huán)境中的力學信號，并使肌動蛋白細胞骨架發(fā)生快速重構，從而激活YAP并啟動相關基因的轉錄，最終促進內皮細胞的增殖、遷移以及形成血管。在細胞感知機械力刺激到發(fā)生基因轉錄水平的變化，YAP介導的力學信號轉導是不可或缺的過程。將血管網(wǎng)絡整合到人工支架中仍是各組織工程領域所面臨的重大挑戰(zhàn)，隨著3D打印技術的發(fā)展，目前可以構建精確幾何結構和層次結構的血管形態(tài)。在這種血管形態(tài)結構中施加外力或調節(jié)內皮細胞所受到的機械應力，則能夠調控內皮細胞形成血管的能力，這可能成為未來組織工程支架研究的新思路。因此，理解機械應力調控內皮細胞形成血管的機制，有助于推動人工支架在皮膚軟組織缺損治療中的應用。