昆蟲(chóng)抗菌肽免疫調(diào)控作用及機(jī)制研究進(jìn)展

許曉燕綜述，夏 嬙審校

0 引 言

免疫系統(tǒng)在機(jī)體識(shí)別和清除外來(lái)病原微生物中發(fā)揮重要作用，分為固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。由于昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期生物進(jìn)化中所形成的地位，使其免疫系統(tǒng)與脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)不同，只有固有免疫系統(tǒng)，細(xì)菌、病毒或藥物等刺激會(huì)啟動(dòng)昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)。昆蟲(chóng)體內(nèi)因不同刺激而產(chǎn)生的免疫物質(zhì)稱為抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)[1]。昆蟲(chóng)抗菌肽作用廣泛，尤其免疫調(diào)控方面的研究備受關(guān)注[2]。

1 昆蟲(chóng)抗菌肽概述

在抗菌肽研究中，昆蟲(chóng)抗菌肽的研究起步最早，科學(xué)家們最先發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是從鱗翅目昆蟲(chóng)惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)中發(fā)現(xiàn)的，命名為天蠶素[3]。目前在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中可以查到的昆蟲(chóng)抗菌肽約有310種。根據(jù)抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能的差異，昆蟲(chóng)抗菌肽大致可分為3類，分別為天蠶素類、防御素類及富含脯氨酸或甘氨酸類。①天蠶素類(cecropia)昆蟲(chóng)抗菌肽：因最初從惜古比天蠶體內(nèi)獲得而得名，目前天蠶素類抗菌肽多從鱗翅目和雙翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)提取，已知的主要天蠶素類抗菌肽有天蠶素A、天蠶素B和天蠶素D，主要由35～37個(gè)不含半胱氨酸的氨基酸殘基組成[4-6]，對(duì)革蘭陽(yáng)性(G+)菌和革蘭陰性(G-)菌均有抑制作用[7-8]；②防御素類(Defensins)昆蟲(chóng)抗菌肽：此類抗菌肽不是昆蟲(chóng)獨(dú)有的抗菌肽，但是在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目等昆蟲(chóng)體內(nèi)均提取到了不同類型的防御素[9]，主要由氨基酸和半胱氨酸殘基組成[10]，昆蟲(chóng)防御素對(duì)G+菌和G-菌均有作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌等G+菌抑制作用更為明顯[11-12]；③富含脯氨酸或甘氨酸類昆蟲(chóng)抗菌肽：富含脯氨酸的抗菌肽因結(jié)構(gòu)中含有豐富的脯氨酸而得名，主要有凝集素(Lebocins)、果蠅菌素(Drosocin)和Metchnikowin等抗菌肽[13]。富含甘氨酸的抗菌肽主要有攻擊素(Attacins)、雙翅菌肽(Diptericins)等抗菌肽。此類抗菌肽能夠抑制大多數(shù)G-菌以及有選擇性的抑制某些G+菌的繁殖[14-16]。

昆蟲(chóng)抗菌肽具有抑制細(xì)菌繁殖、抗病毒、抗真菌及抗寄生蟲(chóng)等多種作用[17-18]。昆蟲(chóng)抗菌肽不僅具有抗微生物活性，還具有抗腫瘤活性，如克隆自美國(guó)白蛾的抗菌肽ABP-dHC-Cecropin A及其類似物能有效殺傷白血病細(xì)胞[19]，蜜蜂的蜂毒肽對(duì)胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[20]，家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽粗提物作用于人肝癌HepG2細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致HepG2細(xì)胞核變形，線粒體膜電位降低[21]，來(lái)自果蠅的抗菌肽可以與腫瘤壞死因子聯(lián)合作用殺死荷瘤果蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞[22]。除此之外，昆蟲(chóng)抗菌肽還具有免疫佐劑作用，陳立青[23]研究證實(shí)，家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽可作為免疫佐劑提高卵白蛋白(OVA)免疫小鼠體內(nèi)IgG抗體效價(jià)、促進(jìn)脾細(xì)胞增殖以及提高NK細(xì)胞的殺傷能力。近年來(lái)隨著對(duì)抗菌肽的深入研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)抗菌肽在免疫調(diào)控中作用越來(lái)越重大[2,24]。

2 昆蟲(chóng)抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)作用

從鱗翅目、雙翅目、膜翅目及鞘翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)提取的抗菌物質(zhì)均具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，如激活免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生等[25]。

2.1鱗翅目昆蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié)作用鱗翅目昆蟲(chóng)主要包括蛾類和蝶類等昆蟲(chóng)，對(duì)此目昆蟲(chóng)抗菌肽的研究主要集中在蛾類昆蟲(chóng)。Wang等[26]在柞蠶蛾(Antheraeapernyi)體內(nèi)提取到了天蠶素B，將天蠶素B的鉸鏈區(qū)切除而獲得一種新型的抗菌肽-天蠶素DH。10 mmol濃度下抗菌肽-天蠶素DH能夠有效抑制RAW264.7細(xì)胞中一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6的表達(dá)，尤其對(duì)NO的抑制率達(dá)到了85%。天蠶素A亦可以有效抑制NO的產(chǎn)生，且具有一定的濃度依賴性。當(dāng)天蠶素A的濃度達(dá)到5μmol時(shí)，可以完全抑制NO的產(chǎn)生，濃度達(dá)到25 μmol，不僅能夠抑制NO的產(chǎn)生，還能夠顯著抑制炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和小鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)- 2 抗體mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮抗菌肽的抗炎作用[27]。將家蠶體內(nèi)富含甘氨酸的抗菌肽(Bombyx mori gloverin A2，BMGlvA2)作用于炎癥小鼠后可以有效減少小鼠脾的損傷、壞死以及脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)高劑量的BMGlvA2(8.0mg/kg)還可以顯著降低炎癥小鼠體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6和 TNF-α的表達(dá)，從而減輕小鼠的炎癥反應(yīng)[28]。

2.2雙翅目昆蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié)作用雙翅目昆蟲(chóng)抗菌肽免疫調(diào)節(jié)的研究主要集中在蠅類、虻類、蚊類等昆蟲(chóng)，其中對(duì)家蠅的研究最為廣泛。在金黃色葡萄球菌刺激下，轉(zhuǎn)導(dǎo)重組家蠅抗菌肽A2(Mdc-A2)慢病毒表達(dá)載體的RAW264.7細(xì)胞株(RAW-Mdc-A2)與未轉(zhuǎn)導(dǎo)Mdc-A2的RAW264.7細(xì)胞株相比，其TNF-α轉(zhuǎn)錄變異體1、2(TNF-α-tv-1、TNF-α-tv-2)的mRNA表達(dá)以及TNF-α的含量均顯著降低，同時(shí)還能下調(diào)IL-1β mRNA的表達(dá)[29]。

從家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)提取的抗菌肽MDPF不僅具有促進(jìn)脾細(xì)胞增殖、提高小鼠體內(nèi)自然殺傷(Natural killer, NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性的作用，還可以提高S180荷瘤小鼠血清中腫瘤抗原特異性免疫球蛋白(Ig)G、IgG2a和IgG2b抗體水平。MDPF對(duì)S180荷瘤小鼠脾細(xì)胞中干擾素(Interferon, IFN)-γ和Th1轉(zhuǎn)錄因子T-bet、STAT-4的mRNA表達(dá)也有明顯的促進(jìn)作用[30]；Chen等[31]研究亦發(fā)現(xiàn)，MDPF不僅可以增強(qiáng)由刀豆蛋白A、脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)等刺激的脾細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞的活性，顯著提高由OVA和rL-H5免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b的滴度，還能顯著促進(jìn)免疫小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-10)細(xì)胞因子。將從馬蠅唾液中提取的天蠶素-TY1(cecropin-TY1)以及從黑蠅唾液腺中提取的抗菌肽SibaCe分別注射到不同小鼠腹腔中，發(fā)現(xiàn)兩種抗菌肽均能夠顯著降低由LPS 誘導(dǎo)小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)以及NO的產(chǎn)生，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)cecropin-TY1和SibaCec均能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達(dá)，并且具有一定的劑量依賴性[32-33]。

在對(duì)埃及伊蚊體內(nèi)抗菌物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，從埃及伊蚊體內(nèi)提取的5種抗菌肽(AeaeCec1、2、3、4、5)在濃度為5 μmol時(shí)可有效抑制LPS刺激產(chǎn)生的iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。以小鼠為研究模型發(fā)現(xiàn)，AeaeCec1-5能有效降低內(nèi)毒素休克小鼠模型中小鼠肺臟、血清和腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，且作用后小鼠肺損傷和水腫等癥狀與對(duì)照組相比均有所減輕。利用AeaeCec1-5治療以大腸桿菌或銅綠假單胞菌感染的小鼠，發(fā)現(xiàn)其可以在一定程度上降低小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，同時(shí)還能夠減少肺組織損傷等不良情況的發(fā)生。無(wú)論是對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠模型的研究還是其他模型的研究，均證實(shí)AeaeCec5是AeaeCec1-AeaeCec5中免疫調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)的抗菌肽[34]。

2.3鞘翅目昆蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié)作用鞘翅目是昆蟲(chóng)綱中第一大目，對(duì)此目昆蟲(chóng)抗菌肽的研究主要集中在蜣螂以及雙叉犀金龜?shù)壤ハx(chóng)方面。Lee等[35]從蜣螂體內(nèi)提取到了一種防御素類抗菌肽-coprisin，25 μmol的coprisin可以使RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、MIP-1、iNOS mRNA的表達(dá)量下降50%以上。Kang等[36]研究coprisin類似物時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，coprisin類似物可以明顯降低由艱難梭菌(Clostridiumdifficile)引起的急性腸道炎癥小鼠回腸組織提取物中IL-6含量，且小鼠的腸道炎癥也得到有效改善。從蜣螂體內(nèi)提取的另一種抗菌肽-CopA3，同樣能夠阻斷梭狀芽孢桿菌A誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥，改善由2%葡聚糖硫酸酯鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥狀，降低小鼠回腸中的IL-6和TNF-α含量[37]。除了蜣螂，Lee等[38]從雙叉犀金龜(Allomyrinadichotoma)體內(nèi)也提取到了一種抗菌肽-Allomyrinasin。Allomyrinasin能夠降低RAW264.7細(xì)胞中NO、iNOS以及COX-2的含量，且具有濃度依賴性，200 μg/mL以上的Allomyrinasin可以有效抑制iNOS和COX-2蛋白表達(dá)以及降低IL-1β和IL-6含量。

2.4膜翅目昆蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié)作用膜翅目昆蟲(chóng)僅次于鞘翅目和鱗翅目，是昆蟲(chóng)目中第三大目，對(duì)于本目昆蟲(chóng)抗菌肽免疫調(diào)節(jié)的研究主要為蜂類、蟻類。在研究蜜蜂來(lái)源的抗菌肽Apidaecin對(duì)人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，Apidaecin能夠上調(diào)T淋巴細(xì)胞共刺激分子CD80的表達(dá)，還能夠抑制巨噬細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex, MHC)II類和CD86含量的增加以及抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子；對(duì)MIP -1 和巨噬細(xì)胞趨化肽(Macrophage chemotactic peptides, MCP)-1的產(chǎn)生亦具有一定的抑制作用[39]。不僅Apidaecin能夠調(diào)節(jié)免疫活性，Apidaecin的一種衍生肽Api88亦能夠濃度依賴性的降低促炎細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生，同時(shí)還能夠提高抑炎細(xì)胞因子IL-10的含量，降低人單核細(xì)胞體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。此外Api88還能夠促進(jìn)人肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而調(diào)節(jié)其細(xì)胞的生物活性[40]。在螞蟻毒液中提取的陽(yáng)離子抗菌肽P17不僅能夠在體外誘導(dǎo)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞釋放活性氧和IL-1β，促進(jìn)炎癥的發(fā)生；還可以刺激小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬白色念珠菌以及產(chǎn)生活性氧和IL-1β，進(jìn)而減輕小鼠胃腸道反應(yīng)，從而治療白色念珠菌感染小鼠[41]。

3 昆蟲(chóng)抗菌肽免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

目前研究認(rèn)為，昆蟲(chóng)抗菌肽在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)控作用主要通過(guò)3條信號(hào)通路進(jìn)行，分別為Toll樣受體信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路[42]。當(dāng)機(jī)體被外來(lái)病原體感染時(shí)，昆蟲(chóng)抗菌肽可以啟動(dòng)不同的通路來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)控作用。

3.1Toll樣受體信號(hào)通路模式識(shí)別受體(Toll-like receptor, TLR)在抗菌肽的免疫調(diào)控中占據(jù)重要地位，是免疫調(diào)控的啟動(dòng)者[43]。TLR包括TLR1～TLR10，其中TLR1、TLR2、TLR4～6主要在免疫細(xì)胞表面表達(dá)，其余的TLR在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。外界異物進(jìn)入機(jī)體后，被免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(TLR2、TLR4等)識(shí)別，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如位于下游的NF-κB和MAPK信號(hào)通路?？咕耐ㄟ^(guò)調(diào)控相關(guān)通路的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性以及TNF-α、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的分泌，從而對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。如從燕尾蝶(Papilioxuthus)體內(nèi)分離到的抗菌肽Papiliocin能夠抑制LPS與RAW264.7細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，從而阻止TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)[44]。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)天蠶素DH和天蠶素B抑制炎性因子的表達(dá)，可能是其能與LPS結(jié)合，進(jìn)而阻止或者干擾LPS與TLR4的相互作用，最終抑制了與TLR4相關(guān)的下游信號(hào)的傳導(dǎo)。從蜣螂體內(nèi)提取到的Coprisn之所以具有抑炎作用，是因?yàn)樗軌蛞种芁PS與TLR4結(jié)合，進(jìn)而阻止其下游NF-κB的核易位[35]。

3.2NF -κB信號(hào)通路研究抗菌肽免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的學(xué)者眾多，目前認(rèn)為核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear Factor-κB, NF-κB)信號(hào)通路是免疫調(diào)節(jié)中的重要調(diào)控者[45]。在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，從黑蠅唾液中提取的抗菌肽SibaCec能夠影響LPS誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路。LPS (100 ng/mL)能夠誘導(dǎo)NF-κB中 p65亞基從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，而SibaCec (10 μg/mL) 對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65亞基移位有明顯的抑制作用，說(shuō)明SibaCec發(fā)揮其抗炎效果是通過(guò)抑制NF-κB炎性信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[33]；Wei等[46]亦指出姚虻抗菌肽cecropin-TY1亦可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，來(lái)減少促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。從埃及伊蚊體內(nèi)提取到的5種抗菌肽(AeaeCec1-5)均具有抑制NF-κB通路中p65磷酸化的作用，尤其是AeaeCec5的抑制率達(dá)到了90%以上[32]。Kim等[44]發(fā)現(xiàn)從燕尾蝶(Papilioxuthus)體內(nèi)分離到的抗菌肽PapiliocinQian能夠抑制NF-κB的表達(dá)，Qian等[28]亦發(fā)現(xiàn)高劑量的BMGlvA2 (8.0 mg/kg) 可以降低NF-κB通路的表達(dá)水平。

3.3MAPK信號(hào)通路抗菌肽發(fā)揮免疫調(diào)控作用的另一條重要通路是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路，該通路廣泛存在于各種動(dòng)物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，包括JNK、p38和ERK三大類亞族。在研究黑蠅抗菌肽SibaCec對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路影響中發(fā)現(xiàn)，SibaCec(10 μg/mL)對(duì)LPS誘導(dǎo)的ERK和p38磷酸化具有明顯的抑制作用[31]；經(jīng)LPS(100 ng/mL)刺激后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JNK、ERK和p38的磷酸化表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。從埃及伊蚊體內(nèi)提取到的五種抗菌肽(AeaeCec1-5)亦可有效抑制MAPK信號(hào)通路中JNK、ERK和p38蛋白的激活[34]；從天蠶中分離出來(lái)的一種新的抗菌肽CecropinA亦能夠抑制MAPK通路中ERK、JNK和p38三種蛋白的磷酸化，從而抑制COX-2的表達(dá)，達(dá)到抗炎的目的[27]。

4 展 望

昆蟲(chóng)是地球上種類最多的生物，其抗菌肽的研究亦備受關(guān)注。目前，昆蟲(chóng)抗菌肽在抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)及抗腫瘤等方面研究均取得了重大進(jìn)展[17-23]。隨著對(duì)昆蟲(chóng)抗菌肽應(yīng)用的深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種免疫調(diào)控作用。因昆蟲(chóng)抗菌肽在參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)時(shí)具有作用時(shí)間長(zhǎng)、不良反應(yīng)少、生物毒性低等特點(diǎn)，在免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)方面具有良好的應(yīng)用前景。但是由于昆蟲(chóng)體內(nèi)抗菌肽含量少，量產(chǎn)的可行性較低，而通過(guò)基因工程、化學(xué)合成等方法雖然能實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)，但是高昂的成本也限制了抗菌肽研發(fā)。隨著各領(lǐng)域?qū)ハx(chóng)抗菌肽研究的深入有望提高其產(chǎn)量，并使其在免疫調(diào)控方面的應(yīng)用取得新的突破。