高通量篩選技術(shù)在體外線粒體毒性評價中的應(yīng)用

虞慧華，藺紅偉，陸文銓，陳萬生，樸淑娟*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場所，同時對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡等生命活動具有十分重要的調(diào)控作用。任何通過直接或間接作用損傷線粒體結(jié)構(gòu)和功能，即引起線粒體毒性的藥物均可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，輕則導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、局部組織細(xì)胞凋亡或壞死，重則引起器官衰竭甚至死亡[1]。一些抗病毒藥、降脂藥、降糖藥、抗生素、解熱鎮(zhèn)痛藥和化療藥物等均因線粒體毒性受到美國食品藥品管理局(FDA)“黑框”警告或被迫撤出市場。基于此，藥物引發(fā)的線粒體毒性引起了醫(yī)藥界與監(jiān)管部門的廣泛關(guān)注和高度重視。歐盟藥品評價管理局、美國FDA等機(jī)構(gòu)推薦或明確要求藥物研發(fā)過程中應(yīng)評價藥物對線粒體的毒性作用[2]。

毒性評價的傳統(tǒng)方法主要是動物體內(nèi)實驗，通過解剖檢查、稱量重量、計算臟器指數(shù)、血液生化學(xué)檢查及病理形態(tài)學(xué)檢查等來發(fā)現(xiàn)受試物的器官毒性，即使用嚙齒類動物和非嚙齒類動物進(jìn)行不同時間段的生物測定。雖然這種方法在評估化合物對人類潛在危害的應(yīng)用中發(fā)揮了重要的作用，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其局限性也逐漸顯露出來[3]。動物體內(nèi)模型通常通量低，價格昂貴且耗時比較長。體外毒性評價由于周期短、成本低和作用機(jī)制易于探明等優(yōu)勢得到快速的發(fā)展，自動化的高通量檢測與篩選更是得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。

高通量篩選(high throughput screening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程，以靈敏、快速的檢測儀器采集實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，以計算機(jī)對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時間對數(shù)以千萬份樣品進(jìn)行檢測并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體運轉(zhuǎn)的技術(shù)體系[6]。目前，高通量毒性評價已成為毒理學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點，并且在理論研究和實際應(yīng)用中都發(fā)揮著重要的作用。高通量體外篩選，通常比用體內(nèi)模型進(jìn)行的分析更有效且更便宜，更利于多種化合物的活性篩選[7]。本文對線粒體毒性評價中應(yīng)用HTS技術(shù)進(jìn)行的檢測方法和手段進(jìn)行介紹，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供一定的參考信息。

1 依據(jù)線粒體毒性發(fā)生機(jī)制進(jìn)行檢測

HTS分析的第一步是明確檢測目標(biāo)的生物學(xué)機(jī)制和化學(xué)評估系統(tǒng)。線粒體毒性機(jī)制包括破壞線粒體膜電位、線粒體形態(tài)和生物功能等[8]。檢測線粒體毒性應(yīng)根據(jù)線粒體損傷機(jī)制來選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法。

1.1 線粒體探針 線粒體探針是指能夠特異性抑制線粒體蛋白的化合物，可用于檢測線粒體的功能。最常用的線粒體探針包括哇巴因、魚藤酮、抗霉素A、寡霉素和三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(FCCP)。哇巴因通過與酶結(jié)合而抑制Na+/K+-ATPase并引起細(xì)胞內(nèi)鈉的增加，線粒體腫脹和耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)的降低。魚藤酮通過阻止電子從鐵硫轉(zhuǎn)移到泛醌而抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ[9]?？姑顾谹抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ中細(xì)胞色素C還原酶，阻止泛醌的氧化并破壞線粒體質(zhì)子梯度[10]。寡霉素抑制ATP合成酶的Fo亞基，阻止ADP磷酸化合成ATP，減少電子沿電子傳遞鏈的流動。FCCP是一種質(zhì)子載體，運輸氫離子通過細(xì)胞膜，使ATP的產(chǎn)生與氧消耗解偶聯(lián)，導(dǎo)致最大OCR。

這些線粒體探針可以通過各種檢測技術(shù)單獨使用或組合使用，以識別線粒體功能障礙的來源。如使用寡霉素可揭示直接由ATP產(chǎn)生的線粒體呼吸量；使用FCCP能夠確定細(xì)胞的最大呼吸能力與基礎(chǔ)呼吸之間的差異；使用抗霉素A、魚藤酮和哇巴因可完全破壞線粒體呼吸，從而揭示非線粒體的細(xì)胞呼吸量。

1.2 活性氧機(jī)制 線粒體功能障礙通常會增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致炎癥、神經(jīng)變性和衰老。ROS包括超氧自由基、羥基自由基、過氧化氫和單態(tài)氧。在正常的生理條件下，ROS的產(chǎn)生和清除受到嚴(yán)格控制，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。破壞線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可導(dǎo)致ROS產(chǎn)生失衡[11]?；钚曰衔飼?dǎo)致線粒體內(nèi)、外脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷。有許多方法可以測量ROS，包括化學(xué)發(fā)光法、熒光探針法和酶活性測定法等[12]。最適用于HTS的檢測方法是使用可滲透熒光ROS指示劑，包括dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)，hydroethidine和線粒體超氧化物熒光探針MitoSOX Red(mito-hydroethidine)[12-13]。

上述許多探針不會直接與ROS反應(yīng)形成熒光產(chǎn)物，從而限制了ROS的直接測定。此外，在細(xì)胞內(nèi)，除線粒體外還有許多ROS來源，因此不能單獨以ROS測定結(jié)果來判定線粒體功能。

1.3 膜電位機(jī)制 線粒體跨膜產(chǎn)生的電化學(xué)梯度是生成ATP不可或缺的因素，線粒體毒性的一種機(jī)制即為破壞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)。四甲基羅丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針(DiOC6)、線粒體膜電位熒光探針(JC-1)是親脂性陽離子染料，由于這些染料帶正電荷，它們在線粒體內(nèi)的積累與MMP成反比[14]。通過將線粒體暴露于上述熒光劑之一來評估化合物對MMP的影響，使用熒光酶標(biāo)儀可對其進(jìn)行定量檢測。熒光成像技術(shù)是線粒體HTS最廣泛使用的技術(shù)，大多數(shù)微孔板讀板器可容納96和384孔板，并具有測量熒光吸收和發(fā)光的能力，使用熒光探針定量檢測MMP破壞的方法已被證實為評估線粒體毒性的有效方法[15]。

熒光探針定量檢測MMP作為評估線粒體功能的方法具有較多優(yōu)勢，但是在分析結(jié)果時要考慮諸多因素。這些探針可測量跨膜電荷的變化，但無法特異性地測量質(zhì)子梯度。為了對結(jié)果進(jìn)行有效分析，研究人員必須選擇正確的染料，以正確的方法觀察細(xì)胞，并需要利用適當(dāng)?shù)膶φ諄泶_認(rèn)。此外，除測定MMP外，還需補(bǔ)充測定，如補(bǔ)充測定細(xì)胞中的ATP水平和OCR等。

1.4 呼吸測定法 呼吸測定技術(shù)在毒理學(xué)研究中可以評估毒性物質(zhì)對代謝和線粒體適應(yīng)性的影響。通過觀察線粒體DNA和酶活性來量化線粒體功能的許多檢測模型在檢測過程中會破壞實驗細(xì)胞或組織，而呼吸測定法可使用熒光細(xì)胞生存力測定法測量細(xì)胞ATP含量來間接評估線粒體功能。在Mg2+、ATP和O2存在的情況下，熒光素被熒光素酶氧化，產(chǎn)生的發(fā)光信號與細(xì)胞產(chǎn)生的ATP的量成正比，可以使用酶標(biāo)儀來定量。通過測定ATP的含量來檢測細(xì)胞生存力和線粒體功能在HTS模型中已廣泛使用[16]。最直接的呼吸測定法是測量OCR。OCR的測量是非侵入性的，可以在孤立的線粒體或組織樣本中測定，在某些情況下還可用于整個生物體的測定。Clark電極和Oroboros儀器已被廣泛用于呼吸測定法。然而，這些方法一次只能檢查少量樣品，重復(fù)性也不理想。使用Seahorse 24孔和96孔細(xì)胞外通量分析儀(XF-24和XF-96，Seahorse生物科技公司)使呼吸測定的HTS成為可能[17]。這項技術(shù)可以對OCR和細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)的微小變化進(jìn)行靈敏的測定。

接觸有毒物質(zhì)后，線粒體基礎(chǔ)呼吸的變化很難確定，也無法獲得有關(guān)線粒體最大呼吸容量下降的信息。XF-96分析儀允許在實驗過程中注入化學(xué)探針，從而能夠更具體地分析出線粒體的干擾來源。通過依次加入ATP合酶抑制劑寡霉素、質(zhì)子解偶聯(lián)劑FCCP、電子傳遞鏈抑制劑魚藤酮和抗霉素A，XF-96能給出線粒體基礎(chǔ)呼吸、ATP周轉(zhuǎn)率、質(zhì)子泄漏、偶聯(lián)效率、最大呼吸率、備用呼吸容量和非線粒體呼吸等信息，可以用來確定線粒體毒性發(fā)生的特定機(jī)制[18]。加入寡霉素可以確定與ATP產(chǎn)生偶合的呼吸分?jǐn)?shù)，加入FCCP能夠使線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，從而導(dǎo)致最大呼吸，改變線粒體功能的化合物通常會導(dǎo)致最大呼吸速率顯著下降。魚藤酮和抗霉素A可以阻止電子通過電子傳遞鏈，OCR的降低提示非線粒體呼吸或電子傳遞鏈功能障礙而導(dǎo)致質(zhì)子泄漏[18]。

細(xì)胞、組織和整個生物體都可以在XF儀器中測量。這項技術(shù)代表了高通量評估細(xì)胞線粒體功能的重大進(jìn)步，現(xiàn)已用于多種線粒體HTS分析[19]。線粒體呼吸是一個復(fù)雜的過程，用于評估線粒體功能的化學(xué)探針也會破壞整個細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)胞器。因此，實驗設(shè)計時要適當(dāng)使用陽性和陰性對照進(jìn)行比較分析，以便更準(zhǔn)確地對數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 線粒體形態(tài)受融合、分裂和線粒體自噬的影響，線粒體的天然異質(zhì)性會影響細(xì)胞功能和對毒性物質(zhì)的敏感性。有毒物質(zhì)的接觸可通過影響線粒體功能、形狀和數(shù)量來改變線粒體亞群的平衡。線粒體自噬是在線粒體損傷或細(xì)胞應(yīng)激后線粒體的降解和循環(huán)。線粒體自噬的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)動力學(xué)可以通過多種方法進(jìn)行評估，包括透射電子顯微鏡、蛋白質(zhì)印跡和熒光顯微鏡[20]。HTS可以通過使用熒光探針壬基吖啶橙(NAO)來測量線粒體中心磷脂的含量，并使用TMRM或MitoTracker來確定膜電位，從而檢測線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。高通量熒光顯微鏡最適合形態(tài)學(xué)HTS檢測，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用也取得了顯著進(jìn)展。流式細(xì)胞術(shù)是一種分析細(xì)胞和細(xì)胞器形態(tài)的有效方法，每秒可評估樣品中的數(shù)千個線粒體，因此流式細(xì)胞儀具有很高的通量，已被廣泛用于線粒體毒性物質(zhì)的篩選。最新式的流式細(xì)胞儀可以整合96、384和1536孔板，從而使該技術(shù)得以用于線粒體的HTS分析[21]。

流式細(xì)胞術(shù)HTS法是一種有效的線粒體形態(tài)學(xué)評價方法，但是由于頻繁使用分離的線粒體而使其具有一定的局限性，因為線粒體在分離過程中可能發(fā)生改變或丟失，從而使形態(tài)學(xué)的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

2 線粒體毒性評價模型

一直以來，毒理學(xué)家認(rèn)為實驗動物能提示人類的某些潛在反應(yīng)，因此常常依靠嚙齒類動物體內(nèi)模型來評估藥物毒性。動物實驗雖然提供了有價值的毒性數(shù)據(jù)，但動物模型通常通量很低，價格昂貴且耗時比較長。用分離的細(xì)胞器或培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外實驗也可以獲得有關(guān)毒性機(jī)制的有價值的數(shù)據(jù)[22]。體外HTS通常比在體內(nèi)模型進(jìn)行的分析更有效且更便宜，更利于多種化合物的毒性篩選。

2.1 離體線粒體檢測模型 離體線粒體檢測通常用于評估化合物對線粒體功能的影響。為了確定線粒體毒性在特定器官中的作用，可以將線粒體分離自感興趣的器官，并在化學(xué)暴露后檢查其形態(tài)和功能[23]。使用分離的線粒體來測量化合物對氧氣消耗的影響，可以避免細(xì)胞或整個生物體中存在任何非線粒體呼吸源，包括過氧化物酶體對呼吸的影響。然而，離體線粒體存在許多實驗上的缺點，使其難以用于HTS毒性實驗中。通常離體線粒體通過細(xì)胞裂解分離，然后經(jīng)過離心分離和純化，這種分離過程可能在檢測之前破壞線粒體，從而使結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，為了獲得高質(zhì)量的線粒體，需要大量的組織，并需在低于4 ℃的溫度下給藥，以維持線粒體功能。在分離的線粒體中檢測氧化磷酸化并不包括代謝和細(xì)胞信號傳導(dǎo)的影響，因此提供的信息也并不完整。

2.2 細(xì)胞檢測模型 體外毒性模型通常使用永生化細(xì)胞系并在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。盡管方便，但這些培養(yǎng)條件導(dǎo)致細(xì)胞不能模擬在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的某些線粒體功能。許多永生化細(xì)胞系來自癌細(xì)胞，因此可能會表現(xiàn)出瓦氏效應(yīng)(Warburg effect)。癌細(xì)胞即使在充足的氧氣存在條件下，也會偏向使用糖酵解取代一般正常細(xì)胞的有氧循環(huán)[24]。因此，腫瘤細(xì)胞系對線粒體呼吸的依賴性較小，對線粒體毒物的抵抗力更強(qiáng)，這降低了它們在檢測線粒體毒性的HTS分析中的實用性。

盡管原代細(xì)胞培養(yǎng)耗時且價格昂貴，但它們是研究化合物對線粒體功能影響的高通量分析的理想選擇。當(dāng)在供氧增加和低葡萄糖或無葡萄糖培養(yǎng)條件下生長時，原代細(xì)胞通常保持分化功能，并表現(xiàn)出與體內(nèi)線粒體相當(dāng)?shù)暮粑吞钱惿俾?。與嚙齒類動物體內(nèi)實驗相比，人類原代細(xì)胞更能表現(xiàn)出與人類相關(guān)的線粒體毒性。

2.3 葡萄糖和半乳糖不同培養(yǎng)條件模型 永生化細(xì)胞和原代細(xì)胞的有氧呼吸水平取決于它們的培養(yǎng)條件。糖酵解只產(chǎn)生ATP的小部分。生物體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞都依賴于氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)生成能量。但是，許多癌細(xì)胞卻是糖酵解活性增強(qiáng)，乳酸生成水平較高[24]。研究表明，一些癌細(xì)胞可以根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖的水平在有氧糖酵解和氧化代謝之間切換[25]。癌細(xì)胞具有在高濃度葡萄糖環(huán)境中抑制呼吸和氧化磷酸化的能力，這種對糖酵解的偏愛效應(yīng)被稱為Crabtree效應(yīng)(又稱為葡萄糖效應(yīng))。因此，依靠糖酵解產(chǎn)生能量的細(xì)胞對線粒體擾動的敏感性較低，這對于檢查和鑒定線粒體毒性物質(zhì)是一項重大挑戰(zhàn)。

解決該問題的一種方法是在細(xì)胞培養(yǎng)基中用半乳糖替代葡萄糖。半乳糖被氧化為丙酮酸的速度比葡萄糖慢得多，迫使細(xì)胞依賴OXPHOS來產(chǎn)生必需的ATP。這種方法盡管有效，但在細(xì)胞培養(yǎng)中使用半乳糖卻有局限性，因為某些細(xì)胞無法分解半乳糖以產(chǎn)生能量。此外，當(dāng)OXPHOS被線粒體毒性物質(zhì)阻斷時，細(xì)胞需要糖酵解才能存活。當(dāng)細(xì)胞暴露于可破壞無葡萄糖培養(yǎng)基中OXPHOS的化合物時，它們將無法進(jìn)行糖酵解并迅速死亡，這會導(dǎo)致在長時間暴露期間難以區(qū)分線粒體毒性物質(zhì)還是細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而得到假陰性的結(jié)果[26]。最近的研究試圖通過使細(xì)胞在兩個階段中生長來克服Crabtree效應(yīng)，即低濃度葡萄糖的初始糖酵解階段和葡萄糖耗盡后消耗乳酸的OXPHOS階段[27]。初始培養(yǎng)時，葡萄糖提供了細(xì)胞增殖所必需的營養(yǎng)成分以維持細(xì)胞生存，而后放置于無葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，細(xì)胞對線粒體毒性物質(zhì)的敏感性增加[28]。

3 小 結(jié)

線粒體毒性評價是每年對進(jìn)入市場的數(shù)百種藥品進(jìn)行有效管理的關(guān)鍵。因此，高效率、大規(guī)模的線粒體毒性分析至關(guān)重要。高通量線粒體毒性評價是在綜合傳統(tǒng)方法和新技術(shù)的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)對受試物線粒體毒性的高效、快速檢測以及對目標(biāo)物的高通量、有目的的檢測與篩選。當(dāng)然，HTS模型作為藥物研究的一種方法，并不是一種萬能的手段，尤其是體外篩選模型，不可能充分、全面反映藥物的藥理作用。但通過HTS標(biāo)記為線粒體毒性的化合物可以優(yōu)先進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以用于包括嚙齒類動物實驗在內(nèi)的二級測定，以便更準(zhǔn)確地預(yù)測未知化合物的線粒體毒性。