結直腸癌肝轉移小鼠模型建立及應用現(xiàn)狀

向彥臻，陳歡，殷佩浩，2a，徐可，2b ，詹月萍，2b

(1.成都中醫(yī)藥大學上海普陀教學基地，上海 200062； 2.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院 a.普外科，b.中西醫(yī)結合腫瘤介入研究所，上海 200062)

結直腸癌是美國第三大最常見癌癥[1],也是中國最常見的惡性腫瘤之一。在全球確診的136萬例結直腸癌中,中國結直腸癌的新發(fā)病例達25.3萬例，是全球結直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)最多的國家[2]。對于結腸癌患者，即使在早期切除原發(fā)病灶也仍有可能發(fā)生轉移,最終導致患者死亡。肝臟是結直腸癌轉移最常見的部位，常經(jīng)門脈循環(huán)行血源性傳播[3]。

結直腸癌肝轉移的生物學過程極為復雜，是由多因素調控、多步驟構成的過程，其具體機制目前仍不明確。肝轉移的過程可分為幾個連續(xù)步驟。首先，原發(fā)腫瘤灶中的癌細胞分泌血管生成因子導致血管擴張，經(jīng)激活蛋白酶的局部作用，癌細胞進入薄壁靜脈血管和淋巴管，從而進入血液循環(huán)，大多數(shù)循環(huán)癌細胞在此過程中受到免疫系統(tǒng)和血流剪切力的攻擊而破壞，存活的癌細胞或團塊形成栓塞阻塞遠處器官毛細血管床，最終癌細胞向肝實質外滲并形成微轉移灶[4]。

深入研究結直腸癌肝轉移的具體機制以及探索有效的抗轉移治療方法，需要建立人結直腸癌肝轉移動物模型。根據(jù)成瘤機制，結直腸癌小鼠造模方法主要分為致癌劑誘發(fā)小鼠成瘤法、基因工程小鼠成瘤法及直接種植腫瘤細胞或組織成瘤法。致癌劑誘發(fā)法耗時長、變異大、組間不易獲得病程及癌塊相似的小鼠?；蚬こ谭ǔ闪雎屎娃D移率低，實驗周期長。故前兩種造模法極少用于結直腸癌肝轉移的造模?，F(xiàn)就結直腸癌肝轉移常用的直接種植法造模及應用情況予以綜述。

1 盲腸種植法

盲腸種植法是開腹后將結直腸癌腫瘤細胞或組織直接移植于盲腸漿膜下所產(chǎn)生的結直腸癌肝轉移模型，此法為原位種植形成的自發(fā)性肝轉移模型，能較為客觀地模擬人類結直腸癌細胞的淋巴道轉移和血運播散，較好地體現(xiàn)結直腸癌的生物學特性。

與腫瘤組織移植法相比，細胞注射法流程簡便、操作易行，且更為常用，建模成功的關鍵在于所選腫瘤細胞的侵襲能力和腫瘤細胞的數(shù)量。為證明微RNA(microRNA，miR)-192的表達能抑制體內結直腸癌細胞向肝轉移，Geng等[5]將綠色熒光蛋白標記的表達miR-192的2×106個HCT116細胞直接注射到4～5周裸鼠的盲腸。4～5周處死裸鼠，切除盲腸及肝臟進行評估發(fā)現(xiàn)，對照組肝轉移發(fā)生率為53%，而miR-192表達組肝轉移的發(fā)生率低至8%。Limani等[6]將MC-38結腸癌細胞注射至C57B1/6小鼠的盲腸壁，用肌醇三焦磷酸酯和FOLFOX(葉酸、氟尿嘧啶、奧沙利鉑)處理小鼠，6周后評估小鼠肝轉移指標，結果顯示，肌醇三焦磷酸酯較FOLFOX抗結腸癌肝轉移作用更明顯。為證實在肝轉移和源于遠處轉移的結直腸癌細胞系中miR-885-5P的表達上調，Lam等[7]將1×106個HCT116細胞原位注射于6～8周的NOD/SCID小鼠的盲腸壁，觀察腫瘤轉移及miR-885-5P的表達情況。細胞注射雖然相對簡便，但接種后的腫瘤細胞易從漿膜中漏出。Zhang 等[8]在建模時做了進一步改善，將含有2×106個結腸癌細胞的10～15 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)用33號微注射器注入野生型C57BL/6和白細胞介素-33(interleukin-33，IL-33)敲除小鼠的盲腸漿膜下，注射部位用組織膠密封、70%的乙醇和PBS清洗，以防止?jié)B漏。6周后處死小鼠，收集并評估自發(fā)性肝轉移腫瘤組織。結果表明，在結腸癌細胞中IL-33的表達增加了腫瘤的發(fā)生和肝轉移。

腫瘤組織移植是將結直腸癌細胞先注射于動物皮下或其他部位，待形成腫瘤塊后再移植到盲腸的方法。由于此法與臨床結直腸癌肝轉移的突破方式和時間更為接近，因而認為其形成肝轉移的可信度更高。但此種方式的手術要求高、過程復雜，且耗時較長。Tao等[9]將2×107個HCT116細胞注射至裸鼠的右腋窩，3周后用無菌技術切除腫瘤并切至1～2 mm3大小，將切下的腫瘤塊移植至48只裸鼠的盲腸中，7 d后隨機分為4組給藥，即對照組、胃腸安組、5-氟尿嘧啶組、胃腸安+5-氟尿嘧啶組，7周后處死裸鼠并收集原位腫瘤、肝轉移瘤及腫瘤鄰近組織，檢查結果顯示，與對照組相比，胃腸安+5-氟尿嘧啶組和胃腸安組肝轉移更少。Agarwal等[10]將非靶向短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt) shRNA2或Akt2 shRNA2轉染的綠色熒光標記的7×106個GEO細胞注射到雄性裸鼠的背側皮下,形成異種移植物后切除腫瘤并切成1 mm3的碎片，將兩塊碎片植入另一只裸鼠的盲腸。采用×7倍放大和顯微外科技術，用8-0尼龍縫合線將異種移植物縫入漿膜下兩個不同位置。由于手術的復雜性，術后每組25只小鼠只有17～22只存活，9周后處死小鼠評估肝轉移，結果表明，Akt2缺失抑制體內結直腸癌轉移。Yang等[11]將2×106個Lovo-Luc細胞懸浮于F12K培養(yǎng)基中，再將0.2 mL懸浮液皮下接種于BALB/c裸鼠的右前肢。當腫瘤生長到約1 cm3時取出皮下腫瘤浸入含有青霉素和鏈霉素的F12K培養(yǎng)基中，腫瘤組織切塊備用。另取裸鼠，在盲腸血供充足處插入備用腫瘤塊，無菌紗布吸取周圍液體，腫瘤表面涂上適量的醫(yī)用OB膠，確保腫瘤擴散至盲腸壁，靜置45 s膠凝固后回納盲腸并關腹，術后7 d開始接受藥物處理3周，最后評估裸鼠肝轉移情況。

2 脾臟種植法

經(jīng)脾臟建立結直腸癌肝轉移模型是最常用的方式，可分為脾臟保留法和去脾法。雖與盲腸種植法相比，其不能客觀模擬結直腸癌肝轉移的宏觀過程,但脾臟種植法可用于篩選高轉移傾向的惡性結直腸癌細胞、研究腫瘤免疫療法、開發(fā)抗轉移藥物等。

保脾法是一種易于實施且重復性好的用于建立結直腸癌肝轉移模型的方法。脾臟是機體的免疫器官，腫瘤細胞經(jīng)過脾臟免疫細胞后轉移至肝臟更符合體內腫瘤轉移過程。此法注射腫瘤細胞時需謹防細胞溢出而造成腹膜內腫瘤。Zhou等[12]將1×106個SW480或SW620細胞懸浮在50 μL PBS中，注入脾遠端，6周后處死小鼠，切除脾臟和肝臟，結果發(fā)現(xiàn)，酸離子通道2過表達促進SW480細胞的肝轉移，其敲除將減少SW620細胞的肝臟轉移。Zhang等[13]將5×105個HCT116細胞注射至BALB/c裸鼠脾臟后，分別用小檗堿和0.9%氯化鈉(對照組)灌腸4周，實驗結束處死裸鼠，收集裸鼠肝臟發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，小檗堿組肝轉移灶的體積明顯較小、數(shù)量較少。

脾臟切除法所建模型可以避免保脾法形成的脾臟原位腫瘤對小鼠的影響，能較好地模擬結直腸癌肝轉移血行轉移過程，形成的肝轉移灶集中而明顯。但切除脾臟易致實驗小鼠死亡，因此此法對實驗要求較高。Shimizu等[14]麻醉小鼠后，在靠近脾臟左側處行0.5 cm切口，用27 G針頭將含有2.0×106個CMT-93結直腸癌細胞的200 μL PBS分別緩慢注射至野生型和血管緊張素Ⅱ亞型受體1α敲除小鼠的脾臟，5 min后取脾關腹，2周后處死小鼠，取出肝臟，與野生型相比，血管緊張素Ⅱ亞型受體1α敲除小鼠肝臟的重量及肝轉移率明顯降低。Zhang等[15]為獲得體內高轉移性結腸癌細胞，將含有1×105個MC38細胞的100 μL PBS注射至C57BL/6小鼠脾臟，5 min后去脾，3周后獲得肝轉移瘤，用膠原酶處理獲得肝轉移瘤細胞，從而提取出單個無菌細胞，選出的細胞再用G418(400 μg/mL)處理至少1周后再次注射至小鼠脾臟，重復9個循環(huán)以獲得高侵襲性的MC38-LM10細胞。Tohme等[16]建立缺血再灌注模型，在再灌注時，用27 G針頭將 5×104個MC38細胞注射至小鼠脾臟，與此同時小鼠接受聚環(huán)氧乙烷或聚乙二醇處理，腫瘤細胞注射10 min后去脾，評估聚環(huán)氧乙烷是否能抑制肝轉移灶的生長。結果顯示，聚環(huán)氧乙烷能減少肝缺血再灌注后新肝轉移瘤的形成。

考慮到保脾法所形成的肝轉移瘤不佳及切脾法對動物自身免疫系統(tǒng)的破壞，在某些實驗中常運用脾臟半切除法，此法可兼顧保脾法和切脾法的優(yōu)點，又能減少兩者對小鼠的傷害。Rahbari等[17]為模擬結直腸癌肝轉移，將脾臟分成兩個部分，將1×105個CT26細胞注射到遠端脾尾部，然后切除注射的脾半球，其余半球保持在原來位置。為評估腫瘤負荷，他們將小鼠隨機分組，并在出現(xiàn)肉眼可見的肝轉移瘤后(注射后8～12 d)開始治療。Chen等[18]將小鼠分為SW620-血管內皮樣蛋白1組和SW620-對照組，麻醉后暴露脾臟，脾臟分為兩半后分別被夾住，將2×106個結直腸癌細胞經(jīng)其中一個半脾的血管注入，經(jīng)PBS沖洗后切斷引流半脾的脾血管，并切除注入腫瘤細胞的半脾，逐層關腹，監(jiān)測肝轉移情況，2個月后對肝轉移瘤進行組織學分析。結果發(fā)現(xiàn)，SW620-血管內皮樣蛋白1組的肝轉移率低于SW620-對照組。

3 肝臟直接種植法

肝臟直接種植法是將結直腸癌細胞或瘤塊直接接種到肝臟所形成的結直腸癌肝轉移灶。肝臟直接種植法雖不能客觀模擬腫瘤細胞的生長、侵襲及轉移的全過程，但成瘤率高，且成瘤速度快，更適合于晚期結直腸癌肝轉移的研究。

肝臟直接種植法中的細胞注射法具有簡單易行、重復性好的特點。Sun等[19]為證明胰島素誘導基因2與結腸癌晚期的關系，在小鼠肝臟右下葉注射胰島素誘導基因2 shRNA或熒光素酶shRNA轉染穩(wěn)定的HT29細胞,在第28天處死小鼠后計算肝左葉的轉移結節(jié)數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的胰島素誘導基因2 shRNA 轉染HT29細胞可顯著抑制非移植肝葉中肝腫瘤結節(jié)的形成。細胞注射法中非常關鍵的一點是防止腫瘤細胞外滲，F(xiàn)ries等[20]對此做了進一步改善，沿腹中線打開腹壁后，用27 G針頭的結核菌素注射器將含有5×105個結腸癌細胞的懸液注射到左肝葉。為了防止腫瘤細胞溢出和出血，壓迫注射部位5 min，隨后關腹。Chou等[21]證明，Scellin在肝轉移性結腸癌細胞系中特異性表達，將結腸癌細胞對照組和Scellin敲除的結腸癌細胞組分別與基質凝膠混合，向5周齡的雄性BALB/c裸鼠肝內注射(1×105個/50 μL)，監(jiān)測腫瘤生長，8周后處死小鼠并檢測肝轉移瘤的生長情況，結果發(fā)現(xiàn)，Scellin的敲除增加了結腸癌的遷移和侵襲。Vasquez等[22]將5×105個MC38細胞注射到6～8周的C57BL/6雄鼠的肝左葉，建立結直腸癌肝轉移模型，用兩種不同劑量的編碼α干擾素的腺相關病毒(adeno-associated virus encoding interferon α，AAV-IFNα)處理小鼠: 1×1010AAV-IFNα、5×1011AAV-IFNα、AAV-熒光素，21 d后測量腫瘤體積發(fā)現(xiàn)，AAV-熒光素組和低劑量AVV-IFNα組小鼠出現(xiàn)了腫瘤，而接受最高劑量的AVV-IFNα小鼠未出現(xiàn)腫瘤。

在部分實驗中，考慮到肝轉移建模的成功率及針對性研究，往往會將腫瘤細胞先注射于小鼠各部位形成腫瘤塊后，再將腫瘤塊植入研究小鼠的肝臟。Murakami等[23]將5×105個綠色熒光蛋白標記的HT29細胞注射至小鼠脾臟上、下極，3周后獲得肝轉移瘤，將形成的腫瘤塊切至8 mm3小塊備用，另取裸鼠暴露其肝臟左葉，將切下的備用腫瘤碎片3 mm3植入肝臟左葉，回納肝左葉并關腹，從而獲得原位肝轉移模型。Hiroshima等[24]將5×105個綠色熒光蛋白標記的HT-29細胞在無血清介質中清洗2遍后注射到4～5周的胸腺裸鼠脾臟，4周形成多葉肝轉移灶后處死裸鼠，獲得結腸癌肝轉移腫塊，另取裸鼠在其肝臟左葉下植入3 mm3先前切下的腫瘤碎片，3周形成單側轉移腫瘤。Sánchez-Velázquez等[25]用轉移性較差的KM12C人結腸癌細胞株皮下植入供體裸鼠體內生長，之后取出形成的腫瘤并切割至2 mm3大小的腫瘤碎片備用，將備用腫瘤碎片植入另一只裸鼠的肝包膜內側并縫合，15 d后結腸癌肝轉移瘤長到適合手術大小，對裸鼠施以不同電壓(2 000 V/cm、1 000 V/cm)的不可逆電泳化，以確定高電泳不可逆化處理裸鼠是否能延長生存期，以及腫瘤組織學是否發(fā)生改變。

4 門靜脈種植法

門靜脈種植法是經(jīng)門靜脈系統(tǒng)注射結直腸癌細胞，經(jīng)過血行轉運至肝臟而形成的結直腸癌肝轉移腫瘤的方法。雖此法不能客觀模擬轉移瘤轉移的臨床特征，但門靜脈易顯露，操作較容易，腫瘤形成速度快，形成率高，是較好的研究晚期結腸癌肝轉移的方法。Kee等[26]為研究CXC趨化因子配體16對大腸癌肝轉移的影響，在C57BL/6小鼠門靜脈注射了SL4(對照組)和SL4CXC趨化因子配體16(細胞組，7.5×104個細胞/200 μL PBS)，17 d后處死小鼠并評估肝轉移情況，結果顯示，腫瘤源性CXC趨化因子配體16的表達抑制了肝轉移。Hashimoto等[27]通過門靜脈將結腸癌細胞注射到12周的NOD/Jic雄性小鼠肝臟，分別在4組小鼠的門靜脈中植入SW480干擾細胞、SW480 Sh-Prune(h-prune敲低的SW480)、HCT116對照細胞和HCT116 Prune(h-prune表達的HCT116)細胞。每周通過體內成像記錄腫瘤的生長情況，4周后評估肝轉移情況。結果提示，h-prune與腫瘤侵襲和遠處轉移相關。

Wu等[28]為確定asporin在結直腸癌肝轉移中的作用，將數(shù)量相等的RKO/NC、RKO/sh1-asporin、HT-29/Vector和HT-29/asporin細胞注入BALB/c裸鼠的門靜脈，6周后取出肝臟進行分析，結果顯示,與HT-29/Vector組相比，HT-29/asporin細胞組肝轉移明顯增加，而與RKO/NC相比，RKO/sh1-asporin組的肝轉移瘤明顯減少。Bocuk等[29]暴露C57BL/6NCrl雄鼠門靜脈，用30 G針頭向門靜脈內注射10 μL含有1×107個CMT-93細胞的PBS緩沖液，4周后處死小鼠并取出肝臟分析轉移情況。Becker等[30]認為，肝臟核磁共振能預測小鼠結腸癌肝轉移，在麻醉小鼠腹部行3 cm切口暴露門靜脈，將1×105個MC38細胞注入8只雄鼠的門靜脈內，另取2只雄鼠注射緩沖溶液作為對照，注射后的第4、8、12、16和20天采用 T2加權自旋回波序列行小型動物磁共振成像,20 d后磁共振成像顯示出現(xiàn)腫瘤。Tauriello等[31]在BALB/c nu/nu小鼠7周時，使用30G注射器向門靜脈內直接注射100 μL結腸癌腫瘤細胞懸浮液以構造結腸癌肝轉移模型。

5 小 結

結直腸癌肝轉移的過程十分復雜，小鼠建模方式的選擇需根據(jù)具體的實驗要求及實驗條件決定。除上述4種常用建模方式外，皮下種植法、尾靜脈種植法、腋窩種植法及腹膜種植法等也是常用的結直腸癌小鼠造模方式，但這些方法因難以表現(xiàn)出惡性結直腸癌細胞向肝臟浸潤和轉移的特性，而不易構建出結直腸癌肝轉移模型。目前，尚未有一種小鼠模型能與人類結直腸癌肝轉移的發(fā)生發(fā)展完全契合，因此需致力于構建新的更便捷、更貼近人類腫瘤發(fā)展進程的動物模型，為揭示結直腸癌發(fā)病、轉移機制及探索治療措施提供有效手段。