BRAF基因在甲狀腺癌中表達(dá)的研究

張茂杰，葉暉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550001； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺外科，貴陽(yáng) 550001)

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，約占全身惡性腫瘤的1%，主要組織學(xué)類型有乳頭狀癌、未分化癌、濾泡性癌、髓樣癌等，前三種類型較常見(jiàn)，分別占甲狀腺癌的80%、2%、15%，其中乳頭狀癌惡變程度較低、預(yù)后較好，除髓樣癌外，多數(shù)甲狀腺癌源自濾泡上皮細(xì)胞[1]。近年來(lái)，我國(guó)甲狀腺癌整體患病率呈遞增趨勢(shì)，在美國(guó)甲狀腺癌已成為威脅居民生命健康的第一位疾病[2]。多數(shù)甲狀腺癌患者在接受合理有效的手術(shù)及放射碘治療后預(yù)后較好，但遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率仍居高不下(>30%)，病死率高達(dá)8%[3]。因甲狀腺癌具有高發(fā)病率、高死亡率等特點(diǎn)，近年來(lái)臨床持續(xù)對(duì)甲狀腺癌致癌基因進(jìn)行研究，旨在找到一種新穎且有效的甲狀腺癌診斷技術(shù)與治療方法。

研究表明，基因點(diǎn)突變及染色體重排是推動(dòng)甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的主要遺傳學(xué)分子機(jī)制[4]。甲狀腺癌突變基因多位于磷脂酰肌醇-3-激酶通路與促分裂原活化的蛋白激酶通路中，鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因是RAS原癌基因、RET原癌基因下游信號(hào)分子，其所編碼的B型有絲分裂原激活蛋白依賴性激酶是促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路主要成分，這一信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖與凋亡均有調(diào)節(jié)作用，一旦該信號(hào)通路發(fā)生改變可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成[5-6]。研究表明，BRAF基因只有在甲狀腺癌與甲狀腺癌起源的未分化癌中才會(huì)發(fā)生突變，有超過(guò)一半的甲狀腺癌患者BRAF V600E點(diǎn)基因被證實(shí)有遺傳學(xué)變化，而在其他甲狀腺良性疾病中暫未被發(fā)現(xiàn)[7-8]。現(xiàn)對(duì)甲狀腺癌組織內(nèi)BRAF基因表達(dá)的臨床意義予以綜述。

1 BRAF基因分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

BRAF基因在1988年被首次發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)人類尤因肉瘤中存在一個(gè)能夠轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系，即NIH3T3細(xì)胞的DNA序列，該DNA序列具有較強(qiáng)的活性，因其基因與A-迅速加速纖維肉瘤(rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf)、C-Raf有高度同源性，故將其統(tǒng)稱為BRAF基因[9]。BRAF基因歸屬于Raf基因家族，位于染色體7q34，有外顯子18個(gè)，是RAS、RET的下游信號(hào)分子，BRAF是Raf基因編碼蛋白質(zhì)，蛋白分子量為94 000，含有氨基酸殘基783個(gè)，參與細(xì)胞繁殖、分化與程序性凋亡，在促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路中有至關(guān)重要的作用[10-11]。Raf、BRAF基因被其他腫瘤原癌基因頻繁激活、BRAF基因的過(guò)度表達(dá)及發(fā)生基因突變均會(huì)直接激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶與促分裂原活化的蛋白激酸/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，致使其直接向促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路下游傳遞有絲分裂信號(hào)，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變及侵襲等行為[12-13]。

2 BRAF基因與甲狀腺癌

在全部惡性黑色素瘤患者中有近70%的患者存在BRAF基因突變[14]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，基因組織技術(shù)與癌基因篩查技術(shù)不斷發(fā)展，經(jīng)這些基因篩查技術(shù)證實(shí)，BRAF基因是一種特異度較強(qiáng)的甲狀腺癌基因，甲狀腺癌患者最常見(jiàn)的基因突變即BRAF基因突變，這種基因突變主要集中于第11位和第15位外顯子，且以第15位外顯子上單個(gè)的堿基因錯(cuò)義突變?yōu)橹?，這種類型的突變?cè)谌縍RAF基因突變中超過(guò)90%，這一突變帶來(lái)的翻譯蛋白600位密碼子所對(duì)應(yīng)的纈氨酸將直接由谷氨酸代替，生成活化的蛋白激酶推動(dòng)甲狀腺癌發(fā)病[15-17]。王萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌可觀察到BRAF基因的突變，主要為BRAF T1799A基因突變，該實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，使用BRAF V600E蛋白一方面能夠誘導(dǎo)小鼠的甲狀腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一方面能在組織內(nèi)含有BRAF V600E蛋白質(zhì)特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘發(fā)甲狀腺癌，根據(jù)此研究結(jié)果推測(cè)BRAF蛋白激活可能參與甲狀腺癌的發(fā)生。

BRAF基因突變僅在有較明顯甲狀腺癌來(lái)源的未分化甲狀腺癌及乳頭狀甲狀腺癌中存在，在其他良性甲狀腺腫塊及髓樣癌中未發(fā)現(xiàn)，且在不同類型甲狀腺癌中該基因突變的表達(dá)情況各異，如典型的乳頭狀甲狀腺癌基因突變表達(dá)為35%～70%，而濾泡變異型甲狀腺癌的基因突變表達(dá)僅為5%～20%[19]。李小強(qiáng)等[20]使用基因測(cè)序法與巢氏聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定107例甲狀腺癌患者的BRAF基因突變的結(jié)果顯示，患者的BRAF基因突變僅在乳頭狀甲狀腺癌中發(fā)生，在93例乳頭狀甲狀腺癌患者中，超過(guò)30%的患者有BRAF基因突變，但在髓樣癌、甲狀腺腺瘤等患者中未檢出突變，該結(jié)果提示BRAF蛋白可作為甲狀腺腫瘤早期良惡性鑒別的一種標(biāo)志物。上述研究結(jié)果均提示在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中，BRAF基因突變起到至關(guān)重要的作用，在臨床上有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.1BRAF基因用于甲狀腺癌鑒別診斷 甲狀腺結(jié)節(jié)是常見(jiàn)疾病，隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)水平提高、各項(xiàng)醫(yī)療設(shè)備的設(shè)計(jì)、應(yīng)用與普及，甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率大大提高，為19%～67%[21-22]。甲狀腺結(jié)節(jié)多為良性病變，通常不需要接受特殊治療，只有在高度懷疑惡性病變或檢出惡性病變時(shí)才需要深入診斷與治療。但一般情況下甲狀腺良惡性病變鑒別難度較高，誤診、漏診率高，故盡早鑒別和診斷結(jié)節(jié)是否已經(jīng)出現(xiàn)惡性病變對(duì)疾病的早期治療意義重大。目前，甲狀腺結(jié)節(jié)的細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)手段主要為甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)，術(shù)前對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)患者實(shí)施細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是現(xiàn)今較理想的甲狀腺腫瘤診斷手段，該技術(shù)通過(guò)向病變區(qū)域內(nèi)部刺入細(xì)針與針管，采用提插的方式切割病灶內(nèi)小組織或細(xì)胞，同時(shí)操作者可借助針管內(nèi)負(fù)壓將切割的小組織或細(xì)胞吸出，涂片并染色，在光鏡下閱片，最終完成病理診斷，是一種靈敏度較高的活體組織檢查手段。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)實(shí)施的主要目的是鑒別診斷腫瘤的良惡性及類型，不僅可用于甲狀腺癌的診斷，同時(shí)也可用于其他腫瘤疾病，特別是近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)影像學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，B超引導(dǎo)細(xì)針穿刺已成為甲狀腺、乳腺、淋巴結(jié)等淺表腫塊早期簡(jiǎn)便、快捷、安全的細(xì)胞學(xué)活檢診斷手段之一。研究證實(shí)，對(duì)細(xì)針穿刺得到的小組織或細(xì)胞樣本實(shí)施細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)檢查的診斷靈敏度和準(zhǔn)確度大大提高[23]。

術(shù)前使用甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)對(duì)患者的基因突變情況檢測(cè)后，根據(jù)結(jié)果對(duì)結(jié)節(jié)是否發(fā)生惡性病變進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)也可用于甲狀腺結(jié)節(jié)(腫瘤)擴(kuò)散及淋巴轉(zhuǎn)移的判定，該技術(shù)得到的結(jié)果與病理結(jié)果基本接近，應(yīng)用該技術(shù)檢查可提高良惡性鑒別診斷的準(zhǔn)確性[24]。但值得注意的是，甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)技術(shù)也有局限性，如無(wú)法分辨配對(duì)物屬于嗜酸性細(xì)胞腺癌還是卵泡狀細(xì)胞癌、可能會(huì)增加惡性腫瘤轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)、穿刺屬于有創(chuàng)操作可能會(huì)損傷到患者的神經(jīng)或血管、若穿刺不到位極易造成陰性結(jié)果的出現(xiàn)而延誤疾病最佳診療時(shí)機(jī)。其次，該技術(shù)對(duì)于部分自身具備BRAF基因突變侵襲性的癌癥患者，其表現(xiàn)出的臨床分期與漸變性癌特性也較差，可能會(huì)影響甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果的判讀?；诖耍鄶?shù)醫(yī)師強(qiáng)調(diào)應(yīng)將BRAF基因突變看作獨(dú)立因素用于甲狀腺結(jié)節(jié)的早期鑒別診斷[25-26]。良性甲狀腺結(jié)節(jié)(腫瘤)患者中均可檢出RAS突變、甲狀腺乳頭狀癌重排等情況，但未見(jiàn)BRAF基因突變，可見(jiàn)因BRAF基因突變具有特異性，在未來(lái)可能成為甲狀腺結(jié)節(jié)早期良惡性鑒別診斷的重要指標(biāo)[27]。

2.2BRAF基因用于甲狀腺癌預(yù)后評(píng)估與治療方案的選擇 目前，對(duì)于甲狀腺癌的早期治療仍存在較大爭(zhēng)議。2014美國(guó)甲狀腺癌治療指南中推薦，甲狀腺癌早期可單純實(shí)施手術(shù)治療[28]；但歐洲學(xué)者則認(rèn)為早期甲狀腺癌患者在接受手術(shù)治療后對(duì)于部分高危者還應(yīng)開(kāi)展131I治療[29]。故如何篩查出早期甲狀腺癌高?；颊撸⒓皶r(shí)在術(shù)后給予其足夠的治療是提高甲狀腺癌早期治療效果需要解決的問(wèn)題之一。Li等[30]在薈萃分析中歸納了既往32個(gè)研究中6 372例甲狀腺癌患者的臨床病理特征與BRAF基因突變相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，BRAF基因突變與甲狀腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)腫瘤大小、甲狀腺外侵犯、腫瘤多灶、患者性別、高細(xì)胞型乳頭狀甲狀腺癌、經(jīng)典乳頭狀甲狀腺癌、包膜缺失相關(guān)；但該研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，32項(xiàng)相關(guān)研究中只有2個(gè)研究為甲狀腺癌患者實(shí)施了中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)，故認(rèn)為未來(lái)還應(yīng)繼續(xù)對(duì)BRAF基因突變是否能夠作為甲狀腺癌早期手術(shù)治療及術(shù)后131I治療的預(yù)測(cè)因子等方面進(jìn)行深入研究。

BRAF基因突變不僅能夠增加甲狀腺癌治療后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，還直接關(guān)系到甲狀腺癌復(fù)發(fā)后攝碘能力喪失情況。Chang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，乳頭狀甲狀腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)患者中有93.52%(101/108)的BRAF基因突變患者對(duì)131I的攝取效果不理想，其中超過(guò)70%的患者131I未攝取，但攝取了18F-脫氧葡萄糖的患者進(jìn)行配對(duì)研究結(jié)果顯示，甲狀腺原發(fā)癌患者BRAF基因突變率接近80%，而復(fù)發(fā)的甲狀腺癌患者BRAF基因突變率則高達(dá)84%，該研究還對(duì)患者進(jìn)行了隨訪，結(jié)果顯示，因病死亡的復(fù)發(fā)性甲狀腺癌患者的攝取18F-脫氧葡萄糖結(jié)果為陽(yáng)性，而攝取131I結(jié)果為陰性，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與BRAF基因突變后經(jīng)某種途徑降低攝碘基因表達(dá)有關(guān)，如促甲狀腺激素受體基因、鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因等。隨著葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1基因表達(dá)升高，乳頭狀甲狀腺癌復(fù)發(fā)者BRAF基因突變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，故推斷乳頭狀甲狀腺癌患者一旦發(fā)生BRAF基因突變，其131I攝入量將減少、糖攝入量將增多，這在一定程度上會(huì)給腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增創(chuàng)造條件、提供能量，增加腫瘤細(xì)胞惡性侵襲程度，同時(shí)也不利于下一步131I的治療[32]。乳頭狀甲狀腺癌患者轉(zhuǎn)移灶因不攝取131I，無(wú)法及時(shí)殺死腫瘤細(xì)胞，故預(yù)后較其他患者差，可見(jiàn)針對(duì)部分BRAF基因突變的乳頭狀甲狀腺癌患者在手術(shù)后實(shí)施131I放射性輔助治療基本無(wú)效，此時(shí)可結(jié)合患者情況考慮為其實(shí)施全甲狀腺切除術(shù)。

2.3BRAF基因用于分子靶向治療 外科手術(shù)治療、分子靶向治療、放療、131I治療、甲狀腺素抑制治療等均是甲狀腺癌主要治療手段。其中131I放射性輔助治療能夠?qū)⒓谞钕侔┗颊咝g(shù)后殘留甲狀腺組織清除，故主要用于轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高患者術(shù)后的鞏固治療；而對(duì)于部分去分化的甲狀腺癌患者，由于身體對(duì)放射性碘治療的靈敏度不佳或?qū)κ中g(shù)實(shí)施無(wú)法耐受，可以檢測(cè)患者相關(guān)基因的突變情況，為其采取合理的靶向治療，這可能為臨床在治療部分?jǐn)z碘能力不佳或攝碘能力徹底喪失的甲狀腺癌患者時(shí)提供新的思考方向[33-34]。

因BRAF基因激活變異促分裂原活化的蛋白激酶途徑在甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，所以可以考慮為患者采用具有選擇特異性的BRAF基因抑制劑進(jìn)行治療，抑制這條激酶途徑，從而達(dá)到抗腫瘤的效果，該假設(shè)可以考慮作為甲狀腺癌的新治療手段[35]。索拉非尼是一種新的多靶點(diǎn)激酶抑制劑，也是近年臨床研究較多的BRAF激酶抑制劑，在藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，索拉非尼用于甲狀腺癌的治療表現(xiàn)出了較好的耐受性；但在Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，部分不攝取131I轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌患者使用索拉非尼治療后，藥物獲益率約為77%，其中甲狀腺球蛋白表達(dá)下降的患者接近70%，這部分患者在用藥結(jié)束后的中位無(wú)腫瘤進(jìn)展生存期約為79周，該結(jié)果提示索拉非尼用于甲狀腺癌的治療一方面能夠經(jīng)抑制BRAF激酶發(fā)揮抗腫瘤功效，另一方面還可對(duì)其他激酶的信號(hào)通路產(chǎn)生抑制，從而對(duì)腫瘤的形成產(chǎn)生抑制的效果[36-37]。BRAF基因突變會(huì)降低甲狀腺癌患者對(duì)131I的攝取，故甲狀腺癌術(shù)后為BRAF基因突變者采取合適劑量的拉索菲尼聯(lián)合大劑量的131I治療，可能會(huì)獲得一定的治療效果。

3 小 結(jié)

基因突變是甲狀腺癌患者常見(jiàn)的遺傳學(xué)事件，是一種能夠預(yù)測(cè)甲狀腺癌臨床表型、評(píng)估治療效果及預(yù)后情況的新型指標(biāo)。BRAF基因可作為細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查的重要補(bǔ)充，幫助臨床醫(yī)師診斷甲狀腺癌，并協(xié)助臨床醫(yī)師為患者制訂合理有效的治療方案，該基因突變檢測(cè)不僅能夠幫助臨床早期診斷與鑒別甲狀腺惡性結(jié)節(jié)、判斷甲狀腺癌的病理類型、評(píng)估甲狀腺癌手術(shù)治療效果，同時(shí)還可用于指導(dǎo)甲狀腺癌手術(shù)切除設(shè)計(jì)，對(duì)選擇敏感病例實(shí)施激酶抑制劑分子靶向治療及131I放射治療等也有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值，應(yīng)用前景廣泛。但BRAF基因突變可利用的檢測(cè)技術(shù)仍有局限性，如診斷流程復(fù)雜、費(fèi)用高昂等；此外，該技術(shù)的使用與研發(fā)中仍存在瓶頸，如用于個(gè)體時(shí)特異度和靈敏度偏低等問(wèn)題尚待解決，仍需要在未來(lái)開(kāi)展更為深入的研究。