冷沉淀凝血因子的制備及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

肖成，徐應(yīng)芳，李江，李薇，把永昌，譚建玲

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院輸血科，昆明 650000)

輸血治療是目前一類重要的治療方法，成分輸血作為一種輸血手段，可有效減少不良反應(yīng)、提高治療效果[1]。臨床輸血經(jīng)歷了全血輸注、成分輸血、限制性輸血這一過程后進(jìn)入患者血液管理時代?；颊哐汗芾硪匝C醫(yī)學(xué)的證據(jù)作為基礎(chǔ)，以患者為中心，采用合理的輸血技術(shù)使需要輸血患者的醫(yī)療效果達(dá)到最優(yōu)化。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著患者血液管理這一新理念在全球范圍的不斷推廣，臨床輸血的安全性、有效性、科學(xué)性得到了巨大提高和改善[2]。自1964年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)冷沉淀以來[1]，冷沉淀凝血因子作為一種血液成分制品越來越多地應(yīng)用于臨床。視情況補充凝血因子可以促進(jìn)患者凝血系統(tǒng)功能的恢復(fù)。冷沉淀凝血因子主要用于治療出血、凝血疾病，在術(shù)中、術(shù)后出血和急性失血的治療中有顯著的止血和促進(jìn)組織修復(fù)的功效[1]。當(dāng)冷沉淀在臨床的需求量逐漸增多的同時，其制備的質(zhì)和量也顯得尤為重要?，F(xiàn)就冷沉淀凝血因子的制備及其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展予以綜述。

1 冷沉淀的制備和保存

冷沉淀是將保存期限內(nèi)的新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)在1～5 ℃的密閉條件下融化后，再利用特殊無菌技術(shù)將血漿中的冷不溶物質(zhì)分離后所得。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》的規(guī)定，F(xiàn)FP的質(zhì)量合格標(biāo)準(zhǔn)是400 mL全血制備的冷沉淀，其纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)≥150 mg，凝血因子Ⅷ≥80 IU；對于冷沉淀中病毒的滅活主要采用有機(jī)溶劑法，主要步驟為：在冷沉淀中加入2%的磷酸三丁酯靜置于37 ℃下，時間為4 h；經(jīng)過滅活病毒后，冷沉淀中磷酸三丁酯的殘量應(yīng)低于10 ppm(1 ppm=1 mg/kg)，聚乙二醇辛基苯基醚 X-45的殘量應(yīng)低于50 ppm；另外，凝血因子Ⅷ、瑞斯托霉素輔因子及具有凝血活性的Fg，這些成分的平均回收率應(yīng)高于93%；需嚴(yán)格控制溫度對冷沉淀進(jìn)行保存，要求冷凍且貯存溫度應(yīng)低于-20 ℃(低于-30 ℃最佳)，若在2～6 ℃保存凍干的冷沉淀制品，保存期是1年[3]。需要特別注意的是未滅活病毒的制品(如小混合血漿制備的冷沉淀)的保存，必須嚴(yán)格控制病毒的傳播。

1.1不同方法制備冷沉淀的質(zhì)量比較 有研究將冷沉淀凝血因子制備儀制備的冷沉淀與低溫融化箱制備的冷沉淀做質(zhì)量的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷沉淀凝血因子制備儀制備的冷沉淀中凝血因子Ⅷ和Fg的水平均高于低溫融化箱制備的冷沉淀，其中Fg的水平約高出10%，凝血因子Ⅷ的水平約高出40%[3]。王飛等[4]將采用虹吸原理手工法與SEPAMATIC-SL (Ⅲ)成分分離機(jī)制備的冷沉淀進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所制備的冷沉淀中凝血因子Ⅷ及Fg的合格率和水平分別為39.38%和16.66%，經(jīng)分析得出，利用較為先進(jìn)的方法和儀器以及標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范所制備出的冷沉淀合格率及有效成分的水平更高。另有研究人員采用不同方法制FFP，分析FFP對冷沉淀凝血因子質(zhì)量的影響，使用全血白膜法常溫制備濃縮血小板分離FFP后，經(jīng)病毒滅活制備的冷沉淀凝血因子在室溫保存后，凝血因子Ⅷ和Fg的水平及活性均降低，且該方法組中凝血因子Ⅷ和Fg水平最低，說明溫度對凝血因子活性有一定的影響，冷鏈過程也影響不穩(wěn)定的Fg和凝血因子Ⅷ的活性；另外，將全血濾除白細(xì)胞過濾FFP、全血分離FFP、全血白膜法制備濃縮血小板分離FFP后均經(jīng)病毒滅活后制備冷沉淀因子，3種方法比較后發(fā)現(xiàn)，全血白膜法制備濃縮血小板分離FFP，經(jīng)病毒滅活后制備冷沉淀因子中Fg和凝血因子Ⅷ的活性最高[5]。

1.2不同時間制備的冷沉淀中凝血因子的比較 《全血及成分血質(zhì)量要求》中要求FFP需在18 h內(nèi)分離，最佳分離時間為6～8 h[6]。罕有研究報道8～18 h分離制備后的冷沉淀是否達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。何亞琴等[6]選取制備時間<8 h、8～18 h的冷沉淀，檢測凝血因子Ⅷ和Fg的水平及合格率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制備時間<8 h的冷沉淀中Fg和凝血因子Ⅷ較制備時間8～18 h的冷沉淀分別高約10.4%和36.8%，兩時間段制備的冷沉淀中Fg的合格率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組冷沉淀總合格率分別為98%和82%，其原因為凝血因子Ⅷ半衰期較短(8～12 h)且相對不穩(wěn)定，時間對凝血因子Ⅷ水平的影響大于對Fg的影響。另外，張春鳴等[7]在對不同貯存溫度和不同貯存時間冷沉淀凝血因子Ⅷ水平及合格率的變化分析發(fā)現(xiàn)，隨著保存時間的延長，凝血因子Ⅷ平均水平逐步下降，而不同保存時間凝血因子Ⅷ水平合格率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但不同儲存溫度冷沉淀中凝血因子Ⅷ平均水平及合格率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3關(guān)于冷沉淀制備的其他相關(guān)研究 近年來還有關(guān)于冷沉淀的其他相關(guān)研究。如有研究對病毒滅活冷沉淀凝血因子未濾除亞甲藍(lán)和病毒滅活冷沉淀凝血因子濾除亞甲藍(lán)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，未濾除亞甲藍(lán)者凝血因子Ⅷ和Fg的水平分別高于濾除亞甲藍(lán)者約14.4%和22.1%，抽檢合格率分別高出5%和40%，結(jié)果顯示，病毒滅活后的冷沉淀不濾除亞甲藍(lán)，各項指標(biāo)經(jīng)檢測后也均與國外標(biāo)準(zhǔn)相符合[8]。因此，為了保證病毒滅活后冷沉淀凝血因子的活性，建議在制備過程中不進(jìn)行亞甲藍(lán)的濾除。另外，研究表明，采用病毒滅活的血漿所制備的冷沉淀其凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的水平均低于FFP所制備的冷沉淀，而兩者間Fg水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[9]。病毒滅活技術(shù)可使血液中的有效成分不同程度地減少，所以在采用此法制備冷沉淀前須考慮血液中有效成分減少的程度。今后工作人員應(yīng)加強(qiáng)對病毒滅活血漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作規(guī)程的研究，確保血漿中有效成分的水平，為進(jìn)一步提高輸血的療效和安全性提供依據(jù)。

目前，血制品的來源主要靠流動采血[3]。這種情況下血液的采集和運輸將更加耗時、耗材，也會給冷沉淀的制備造成時間上的不便。隨著時間的延長，冷沉淀中有效成分的活性和水平會不斷下降，特別是凝血因子Ⅷ這種半衰期較短的成分。此外，一些理化等因素也影響冷沉淀中有效成分的水平和效用?？傊?，隨著臨床對冷沉淀需求的不斷增加，為有效利用血資源應(yīng)選擇優(yōu)質(zhì)、高效的冷沉淀制備方法，同時應(yīng)該進(jìn)一步完善血液采集、分離及保存等流程的要求，不斷提高冷沉淀制備的質(zhì)量。

2 冷沉淀的臨床應(yīng)用

冷沉淀通常是由多個全血捐贈者的血制品制備而來[10]，并置于低溫冷藏的環(huán)境中。將冷沉淀取出后應(yīng)立即置于37 ℃水浴箱中融解，過程中需仔細(xì)查看冷沉淀袋是否破損，若有漏袋，應(yīng)按報廢處理；在其融化后需在6 h內(nèi)輸注，不可再次冷藏，若在環(huán)境溫度下超過4 h，需要評估冷沉淀可能被細(xì)菌污染的潛在風(fēng)險[11]。目前，冷沉淀主要用于各種外科手術(shù)、肝臟疾病、產(chǎn)科患者、失血性休克[10]、血液疾病的治療和重癥監(jiān)護(hù)病房患者的搶救，其原理是補充患者體內(nèi)缺乏的凝血因子Ⅷ和Fg(質(zhì)與量的不足)，包括血管性假血友病、血友病A和彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)患者等[12]。近年來，冷沉淀還被用于燒傷患者皮膚的創(chuàng)面愈合和生物工程等[13]。盡管冷沉淀輸注應(yīng)用于臨床多年，但對其功效評估的研究較少。

2.1冷沉淀應(yīng)用于新生兒 美國的一項報道稱，自2013年1月開始，新生兒冷沉淀的輸注量從每次10 mL/kg調(diào)整至最大1 U[14]。Tkach等[14]將2008年1月至2015年2月在克里斯蒂安娜醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房接受冷沉淀輸注治療的所有嬰兒進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)在冷沉淀輸注量的規(guī)定改變之前，足月嬰兒比早產(chǎn)兒更容易接觸1個以上的捐贈者(75%比6%)，而規(guī)定更改后，每次足月嬰兒接觸的捐贈者平均不足1個，但輸注治療后Fg的增加量與規(guī)定更改前差別不大，驗證了限制冷沉淀輸注，新生兒每次輸注1 U足以增加Fg水平，同時也限制供體的醫(yī)療暴露和醫(yī)療成本的降低，且足月兒輸注1 U的冷沉淀療效最為顯著。未來的研究可沿著改進(jìn)冷沉淀的輸血實踐方向進(jìn)行，包括適于患者輸注的Fg水平以及冷沉淀輸注與臨床結(jié)果的廣泛關(guān)聯(lián)等方向。

2.2冷沉淀應(yīng)用于外傷和產(chǎn)科 近些年，有學(xué)者對外傷患者給予兩個標(biāo)準(zhǔn)劑量的冷沉淀并維持其紅細(xì)胞的平均值，再測定Fg水平，結(jié)果顯示，接受與未接受冷沉淀患者的Fg水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；此外，在輸注第一個12 U的紅細(xì)胞期間，接受與未接受冷沉淀的患者的24 h或28 d的病死率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[15]。另一項針對軍隊醫(yī)院創(chuàng)傷患者的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)g與紅細(xì)胞比例高(≥原每單位輸注的紅細(xì)胞含有的0.2 g的Fg)是住院生存率提高的獨立相關(guān)因素[16]。目前，產(chǎn)科出血患者應(yīng)用冷沉淀以減少出血和輸血，但并沒有給出確切的指南用以指導(dǎo)臨床[17]。但對伴有凝血功能障礙產(chǎn)后出血的救治，應(yīng)盡早給予冷沉淀聯(lián)合新鮮冰凍血漿以補充凝血因子[18-19]。

2.3冷沉淀凝血因子應(yīng)用于肝硬化合并消化道出血 肝臟疾病患者常會伴有嚴(yán)重的凝血功能障礙，究其原因主要是脾功能亢進(jìn)及肝臟凝血因子合成量減少等，導(dǎo)致血小板數(shù)量減少及血小板功能抑制[20]。肝硬化的患者往往伴有肝門靜脈高壓，會致食管胃底靜脈曲張，進(jìn)而發(fā)生破裂出血[21]。李秀伶等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在肝硬化合并消化道出血的患者中，輸注冷沉淀組患者的搶救成功率為92.1%(35/38)，顯著高于未輸注冷沉淀組的77.8%(14/18)，止血效果顯著。馬經(jīng)瓊和朱振新[22]報道，16例肝硬化合并消化道出血的患者輸注冷沉淀后的治愈率為93.75%，平均輸注劑量為(13.8±4.7) U?？梢?，采用冷沉淀可提高循環(huán)血中各種凝血因子及Fg的水平，縮短凝血時間，糾正凝血異常，止血快、效果佳。但需要注意的是，輸注治療可能會加重患者門靜脈高壓癥，導(dǎo)致出血傾向增加[10]。

2.4冷沉淀凝血因子應(yīng)用于外科手術(shù) 對于外科手術(shù)引發(fā)DIC的患者輸注冷沉淀后血漿凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間及凝血酶時間顯著縮短，在治療中大部分患者在輸注冷沉淀30 min左右出血顯著減少[16]。分析原可能為冷沉淀中的凝血因子Ⅰ是凝血共同途徑的效應(yīng)分子，其水平增加可使內(nèi)外源凝血途徑協(xié)同加快，還可使血小板的聚集增強(qiáng)，而冷沉淀中的凝血因子Ⅷ促進(jìn)可溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)化為堅固的纖維蛋白，以達(dá)到止血的目的。日常工作中必須密切觀察患者的臨床表現(xiàn)，并動態(tài)監(jiān)測血常規(guī)及凝血功能等指標(biāo)。當(dāng)患者有DIC傾向時，先足量輸注同型冷沉淀，緊接著輸注適量的懸浮紅細(xì)胞和適量的新鮮冰凍血漿以及時補充凝血因子，增加紅細(xì)胞的攜氧能力，這樣既能將對患者臟器的損害降到最低、增加搶救成功率，也能節(jié)約血液資源[23]。在心臟手術(shù)的研究中，施用冷沉淀的患者失血較少，并且使用FFP的劑量也更少[10-11]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，接受主動脈手術(shù)并伴有低溫循環(huán)停滯的患者給予冷沉淀，患者平均Fg水平上升約25%，這有助于減少術(shù)中出血量[24]。然而，也有報道稱，心臟手術(shù)期間冷沉淀的輸注是患者5年病死率增加的獨立相關(guān)因素[25]。

2.5其他 采用機(jī)采血小板聯(lián)合冷沉淀治療可使大失血患者凝血功能得到顯著改善，主要表現(xiàn)為血漿凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間降低幅度及Fg、血小板升高幅度增加，減少了血小板與冷沉淀的輸注量，縮短了平均住院時間，故有利于進(jìn)一步縮短臨床治療時間[26-27]。據(jù)報道，冷沉淀還可降低感染患者Slit2蛋白的表達(dá)量，說明感染性疾病可采用冷沉淀作為輔助治療[28]。初步的研究認(rèn)為，冷沉淀可有效糾正患者凝血功能紊亂狀態(tài)，從而改善因凝血功能障礙導(dǎo)致的出血所造成的貧血狀態(tài)，進(jìn)而提高患者的攝氧能力，以促進(jìn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的恢復(fù)與平衡[29]。對于無出血患者行侵入性操作前進(jìn)行預(yù)防性輸注，其纖維蛋白的閾值和最佳輸注劑量目前還無確切指導(dǎo)數(shù)據(jù)[27]。若患者在治療過程中出血風(fēng)險較大(如有用藥史、出血史及操作的出血風(fēng)險較高)且Fg<1 g/L，可視情況輸注冷沉淀，劑量為一組10 U[28]。與輸注其他血液成分相同，冷沉淀的輸注也可能導(dǎo)致患者發(fā)生不同程度的不良反應(yīng)，主要是非溶血性不良反應(yīng)(蕁麻疹、發(fā)熱和寒戰(zhàn)等)。需要注意，血友病患者輸注冷沉淀后，有可能產(chǎn)生凝血因子Ⅷ抑制物(抗體)，另外，供血者的選擇和血制品篩選過程日趨嚴(yán)格，仍存在細(xì)菌污染所致的敗血癥和肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等病毒傳播疾病的發(fā)生。近年來個別患者因輸注的冷沉淀中含有高滴度同種凝集素而導(dǎo)致溶血的案例也有報道[30]。

3 小 結(jié)

隨著成分輸血及凝血因子制品的推廣，冷沉淀凝血因子在治療出血性疾病中的應(yīng)用也逐漸增加。目前冷沉淀廣泛應(yīng)用于燒傷、創(chuàng)傷、DIC等內(nèi)外科疾病。所以，高質(zhì)量、更合理的制備、保存、輸注冷沉淀對降低患者不良反應(yīng)發(fā)生率具有重要意義。隨著臨床對冷沉淀需求量的不斷增加，應(yīng)盡可能地選用合理的方法制備冷沉淀，保證其制備質(zhì)量。冷沉淀結(jié)合其他血液成分輸注治療可有效改善患者的凝血功能，但具體的使用劑量尚未有明確的指南進(jìn)行指導(dǎo)。未來各科室可沿著符合本科室的治療實際情況進(jìn)行更深入的探究。