環(huán)狀RNA在頭頸部腫瘤中的研究進(jìn)展

楊麗可,孫亞男

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，哈爾濱 150001)

頭頸部腫瘤是人類常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)病率在所有腫瘤中居第六位。頭頸部腫瘤會(huì)降低患者生活質(zhì)量，并產(chǎn)生巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)，吸煙、飲酒和人乳頭瘤病毒感染，是最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素。近5年，盡管腫瘤的治療方面取得了一定進(jìn)展，但頭頸部腫瘤患者的生存率仍為50%，許多頭頸部腫瘤患者在診斷時(shí)腫瘤已轉(zhuǎn)移，但目前沒(méi)有可用于監(jiān)測(cè)早期頭頸部腫瘤患者局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的工具[1-2]。因此，尋找可以識(shí)別患者腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物尤為重要。多種類型的RNA，包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)和微RNA(microRNA，miRNA)參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中各信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達(dá)水平可為新型腫瘤標(biāo)志物的研究提供新的角度[3]。研究表明，幾種circRNA通過(guò)miRNA或蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)糖類、脂質(zhì)及氨基酸的代謝，說(shuō)明circRNA是非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分[4]。現(xiàn)通過(guò)總結(jié)與頭頸部腫瘤相關(guān)的人類circRNA文獻(xiàn)，探討近年國(guó)內(nèi)外關(guān)于circRNA與腫瘤增殖、侵襲等的關(guān)系，對(duì)circRNA的結(jié)構(gòu)、特征、作用、發(fā)生機(jī)制及與頭頸部腫瘤治療方向的潛在價(jià)值等予以綜述。

1 circRNA的結(jié)構(gòu)、特征、作用及發(fā)生機(jī)制

1.1circRNA的結(jié)構(gòu)及特征 circRNA由單個(gè)RNA分子末端共價(jià)形成，無(wú)5′及3′核糖核苷酸末端結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中circRNA豐富、保守、穩(wěn)定，并且表具有時(shí)空特異性。

1.1.1豐富性 隨著科技的進(jìn)步與觀念的更新，人類通過(guò)基因組學(xué)找到了更多關(guān)于circRNA存在的證據(jù)。Salzman等[5]鑒定了2 000例人類、1 900例老鼠以及700例線蟲(chóng)的circRNA測(cè)序資料，證實(shí)了50種circRNA的存在，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中均有circRNA表達(dá)。Jeck和Sharpless[6]發(fā)現(xiàn)大約1/8的表達(dá)基因可產(chǎn)生circRNA，而且環(huán)狀分子的豐度是相關(guān)線性mRNA的10倍以上。Memczak等[3]也在大量研究中發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞類型和發(fā)育階段也存在大量circRNA特異性表達(dá)。因此，circRNA的研究有據(jù)可循。

1.1.2高度保守性 內(nèi)含子形成的circRNA通過(guò)2′,5′-磷酸二酯鍵連接首尾兩端，而外顯子形成的circRNA則通過(guò)3′,5′-磷酸二酯鍵首尾相連接，說(shuō)明特殊的反向剪接具有高度的保守性。研究發(fā)現(xiàn)，人類成纖維細(xì)胞中的457circRNA可與小鼠的circRNA匹配，相同的circRNA可表達(dá)于腦、睪丸、胃、肝、腎，甚至大多數(shù)circRNA橫貫了真核生物的一生，circRNA在真核基因中表現(xiàn)出古老、保守的特性，因此在不斷變化的分子生物學(xué)研究中，這一特性成了一個(gè)標(biāo)桿[7-9]。

1.1.3穩(wěn)定性 circRNA在細(xì)胞質(zhì)中可以抵抗脫支酶和RNA核酸外切酶降解，因而可以穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，使研究過(guò)程更加平穩(wěn)有序、降低了探索過(guò)程中的不確定性、提高了得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能[5]。

1.1.4時(shí)空特異性 circRNA在同一生物的不同發(fā)育階段、同一發(fā)育階段的不同部位均表現(xiàn)出表達(dá)差異性[3,5,10]。這樣的差異豐富了生物多樣性，揭示了分子生物學(xué)的研究中生物機(jī)體運(yùn)轉(zhuǎn)的高效性。

1.2circRNA的作用 circRNA的生物作用包括5個(gè)方面：海綿效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、環(huán)形翻譯、circRNA介導(dǎo)的擬基因以及干擾剪接，circRNA的位置、結(jié)合位點(diǎn)、表達(dá)方式不同[11]。①海綿效應(yīng)：circRNA的超級(jí)海綿被認(rèn)為是一種新的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，可通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)海綿化并抑制相關(guān)miRNA。②轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞核中大多數(shù)circRNA(由內(nèi)含子形成)位點(diǎn)幾乎沒(méi)有miRNA結(jié)合功能，但敲低circRNA會(huì)阻礙相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。③環(huán)形翻譯：如果circRNA包含直接與核糖體結(jié)合的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列，則已證明可以在真核細(xì)胞中翻譯[13-15]。④circRNA介導(dǎo)的擬基因：在研究circRNA的過(guò)程中，應(yīng)注意circRNA衍生的擬基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，circRNA衍生的擬基因暗示了circRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座對(duì)宿主基因組的影響[11]。⑤干擾剪接：環(huán)化過(guò)程影響選擇性剪接circRNA通常被認(rèn)為是源自蛋白質(zhì)編碼基因剪接過(guò)程的獨(dú)特功能性副產(chǎn)物，目前鑒定出的大部分circRNA由外顯子衍生，因此此類circRNA的形成過(guò)程可能會(huì)影響相關(guān)前體mRNA的選擇性剪接，從而導(dǎo)致基因表達(dá)改變。

1.3circRNA的發(fā)生機(jī)制 circRNA不同于線性RNA的剪接，包括外顯子套索環(huán)化和內(nèi)含子配對(duì)環(huán)化[16]。

1.3.1circRNA的外顯子套索環(huán)化 外顯子套索環(huán)化的形成機(jī)制為直接反向剪接和外顯子跳讀[17]。直接反向剪接是通過(guò)外顯子上游的5′頭與外顯子下游的3′尾配對(duì)，外顯子環(huán)化形成circRNA，外顯子跳讀是指內(nèi)含子跳讀形成的套索，隨著包含相應(yīng)的外顯子套索內(nèi)部的拼接，多余的內(nèi)含子被切除形成circRNA。

1.3.2circRNA的內(nèi)含子配對(duì)環(huán)化 內(nèi)含子有3種不同的剪接方式：自我剪接、酶促剪接以及核mRNA前體剪接。這3種剪接方式均為前體mRNA中的2個(gè)內(nèi)含子通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成套索，再切除內(nèi)含子，然后形成circRNA。

2 circRNA與腫瘤的關(guān)系

2.1circRNA與鼻腔鼻竇惡性腫瘤 雖然鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，但在各種解剖學(xué)亞位點(diǎn)的相對(duì)發(fā)病率各不相同。相對(duì)于頭頸部其他部位的鱗狀細(xì)胞癌百分比(65%～70%)，鼻腔鼻竇的鱗狀細(xì)胞癌占比相對(duì)較小，僅占頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的3%～5%[18]。鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌具有高度惡性，加之位置隱蔽、早期癥狀不明顯，在臨床中往往預(yù)后不良。鼻腔鼻竇惡性腫瘤病理類型主要包括嗅神經(jīng)母細(xì)胞瘤、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、未分化癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、惡性黑色素瘤、腺樣囊性癌、血管周細(xì)胞瘤、淋巴瘤和軟組織肉瘤等[19]。上頜竇腫瘤早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)引起一定程度的破壞，如已經(jīng)侵犯竇腔的骨質(zhì)或周?chē)M織，當(dāng)這種腫瘤被局限于竇腔時(shí)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并不常見(jiàn)，但當(dāng)侵犯面部、面部皮膚、翼腭窩、口周豐富的軟組織時(shí)，轉(zhuǎn)移到局部或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的情況比較常見(jiàn)。上頜竇腫瘤的治療多采取手術(shù)治療、放療和化療，沒(méi)有分子水平上的治療，且現(xiàn)有研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與鼻腔鼻竇惡性腫瘤相關(guān)的具體circRNA，也沒(méi)有確切提出功能及作用，因此尋找相關(guān)的circRNA尤其重要。

2.2circRNA在鼻咽癌的發(fā)展和侵襲中的作用 鼻咽癌是與EB病毒相關(guān)的頭頸部腫瘤，具有種族差異和地域分布差異，主要發(fā)生于東亞、東南亞及北非國(guó)家[20]。而在中國(guó)，鼻咽癌是中國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部惡性上皮腫瘤，是嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的一種惡性腫瘤[21-22]。鼻咽癌的傳統(tǒng)治療大多以放療為主聯(lián)合化療及靶向治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，并會(huì)出現(xiàn)放療后出血等一系列并發(fā)癥，且患者5年生存率為70%[23]。Wei等[24]通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)評(píng)估circ_0008450的機(jī)制，結(jié)果顯示circ_0008450在鼻咽癌組織和細(xì)胞中升高，沉默的circ_0008450可以抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的特性并增加凋亡細(xì)胞數(shù)量，異位表達(dá)circ_0008450加強(qiáng)了惡性生物學(xué)行為，且circ_0008450減少了miR-577介導(dǎo)的趨化因子配體9抑制，促進(jìn)了鼻咽癌的發(fā)生?？傊?，circ_0008450通過(guò)調(diào)節(jié)miR-577/趨化因子配體9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在鼻咽癌細(xì)胞中充當(dāng)致癌基因。Zhu等[25]研究表明，高表達(dá)的circ-ZNF609吸附miR-150-5p上調(diào)特異性β1糖蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。Shuai等[26]進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)以測(cè)定鼻咽癌和鄰近組織中circRNA_100783、circRNA_0000285和circRNA_100782的水平，并在鼻咽癌患者和健康對(duì)照人群的血清樣品中進(jìn)一步證實(shí)了circRNA_0000285水平，研究顯示與健康對(duì)照組的鄰近組織和血清樣品相比，鼻咽癌患者的腫瘤組織和血清樣品中circRNA_0000285顯著增加。因此，circRNA_0000285可能是鼻咽癌一種新的生物標(biāo)志物，參與鼻咽癌的放射敏感性。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近組織相比，在鼻咽癌組織中circRNA_000543表達(dá)上調(diào)，且放射抗性樣品中的表達(dá)量較放射敏感性鼻咽癌組織樣品中更高，與低 circRNA_000543患者相比，高circRNA_000543表達(dá)鼻咽癌患者的總體生存率較差，進(jìn)一步研究表明，circRNA_000543通過(guò)靶向miR-9/血小板衍生生長(zhǎng)因子受體B軸沉默circRNA_000543，提高鼻咽癌細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，說(shuō)明circRNA_000543可能是鼻咽癌抗輻射的潛在靶標(biāo)。以上相關(guān)標(biāo)志物高表達(dá)時(shí)均有強(qiáng)烈的致癌傾向，有助于新的腫瘤標(biāo)志物的選擇。

2.3circRNA與口腔癌的發(fā)展和侵襲中的作用 口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見(jiàn)、危害最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。口腔癌是一種多因素腫瘤，缺乏有效和準(zhǔn)確的治療、診斷工具，因此需要尋找用于及時(shí)檢測(cè)和患者分層的可靠生物標(biāo)志物。circRNA是各種癌癥的生理和病理過(guò)程中的關(guān)鍵因素，也反映了口腔癌的發(fā)展和進(jìn)展。

2.3.1circRNA在口腔癌細(xì)胞及組織中的表達(dá) Li等[28]研究表明，has_circ_0008309在45組口腔癌樣本中顯著下調(diào)，并且在病理變異上有相關(guān)性。除此之外，Su等[29]發(fā)現(xiàn)，與成對(duì)的非癌癥匹配組織相比，OSCC組織中hsa_circ_0005379的表達(dá)顯著降低，并且與腫瘤大小和分化相關(guān)。hsa_circ_0005379的過(guò)表達(dá)有效抑制了體外OSCC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，并抑制了體內(nèi)裸鼠OSCC的生長(zhǎng)，研究表明，hsa_circ_0005379可能參與表皮生長(zhǎng)因子受體通路的調(diào)控，此外，研究還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005379的高表達(dá)可以顯著增強(qiáng)OSCC對(duì)西妥昔單抗藥物的敏感性。Ouyang等[30]經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，has_circ_0109291在OSCC組織與其他細(xì)胞系的組織相比有明顯提高，并且高表達(dá)的has_circ_0109291往往預(yù)后更差，這說(shuō)明此RNA可能成為OCSS治療的新靶點(diǎn)。另有研究顯示hsa_circ_001242在OSCC中表達(dá)下降，并且可以作為診斷和治療OSCC的潛在新型生物標(biāo)志物[31]。Zhao等[32]通過(guò)大量臨床樣本發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照人群的唾液相比，OSCC患者的唾液中有12種上調(diào)和20種下調(diào)circRNA，在差異表達(dá)的circRNA中，hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971和hsa_circ_0008068上調(diào)，與健康組相比，OSCC組hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632和hsa_circ_0008792下調(diào)，這是第一項(xiàng)證明唾液hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971作為診斷OSCC的生物標(biāo)志物的潛力的研究。在OSCC的circRNA的研究中，上調(diào)下調(diào)的circRNA均有體現(xiàn)，因此規(guī)范腫瘤標(biāo)志物的類型及探索方向的調(diào)整尤為重要。

2.3.2circRNA與口腔癌相關(guān)機(jī)制 hsa_circ_0007059可通過(guò)蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路改變細(xì)胞生長(zhǎng)，是OSCC潛在的預(yù)后(或治療)靶點(diǎn)[33]。Chen等[34]研究表明，沉默circRNA_100290可顯著降低細(xì)胞增殖速度，抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，但會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在口腔癌中，circRNA_100290在miR-29家族中發(fā)揮海綿作用。circRNA_100290可充當(dāng)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA以抵消miR-378a介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1抑制，從而促進(jìn)OSCC中的糖酵解和細(xì)胞增殖[35]。上述研究表明circRNA在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，提示了口腔癌復(fù)雜的機(jī)制，參與了癌癥不同表型，如增殖、凋亡、侵襲等。

2.4circRNA與喉癌發(fā)展及侵襲中的作用 喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，治療包括手術(shù)治療、放療及化療，但患者5年生存率仍然不盡如人意。circRNA研究中，F(xiàn)an等[36]研究表明，LSCC組織中hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529顯著上調(diào)，hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529最可能潛在的靶miRNA分別為hsa-miR-4726-5p和hsa-miR-4640-5p，功能分析顯示，hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529參與了膠原蛋白的合成過(guò)程。Wu等[37]認(rèn)為，circRNA hg19_circ_0005033可促進(jìn)喉癌干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和化療耐藥。Tian等[38]研究發(fā)現(xiàn)，circRASSF2在LSCC組織和LSCC細(xì)胞系中與成對(duì)的相鄰非腫瘤組織和正常細(xì)胞相比顯著上調(diào)。此外，敲除circRASSF2可顯著抑制體外細(xì)胞增殖和遷移，miR-302b-3p抑制劑可阻斷細(xì)胞增殖和遷移。綜上，通過(guò)與miR-302b-3p相互作用并減少抑制素樣生長(zhǎng)因子1受體表達(dá)，可使circRASSF2沉默抑制LSCC的進(jìn)展。

目前并沒(méi)有明確、可應(yīng)用于臨床的新型標(biāo)志物，也沒(méi)有能夠體現(xiàn)腫瘤發(fā)展的不同階段的測(cè)試方法，在擁有先進(jìn)醫(yī)療保健系統(tǒng)的國(guó)家，喉癌的病死率正在下降，但相關(guān)并發(fā)癥如咳嗽、聲音嘶啞、吞咽困難和呼吸困難，仍然給患者帶來(lái)巨大痛苦。因此，闡明重要的分子發(fā)病機(jī)制將對(duì)潛在的喉癌具有重要意義。

3 circRNA是潛在的頭頸部腫瘤的靶點(diǎn)

circRNA活躍于人體細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的許多信號(hào)通路中。circRNA對(duì)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)起到了重要作用，而腫瘤的轉(zhuǎn)移則與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化具有極大的相關(guān)性。在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去特征，例如細(xì)胞間黏附和細(xì)胞極性的喪失，細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)性，并且遷移病情，如成為間質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，circRNA與腫瘤的轉(zhuǎn)移與患者的預(yù)后密切相關(guān)，且證明了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad途徑是各種癌癥類型的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的正調(diào)節(jié)劑[39]。因此，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可以通過(guò)檢測(cè)癌旁組織中的circRNA的變化預(yù)測(cè)和鑒別。目前的分析表明，circRNA的高表達(dá)與人類癌癥的臨床病理和預(yù)后之間存在明顯關(guān)聯(lián)，有希望成為癌癥的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[40]。盡管如此，仍需更多采用標(biāo)準(zhǔn)化方法的大規(guī)模研究為circRNA的預(yù)后價(jià)值提供新的見(jiàn)解。

circRNA也有一些診斷的缺點(diǎn)。首先，一些circRNA的存在需要患者的病理組織進(jìn)行鑒別與診斷，屬于有創(chuàng)操作，增加了感染與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。其次，檢測(cè)組織或外泌體中circRNA的臨床及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查較昂貴，限制了生物標(biāo)志物circRNA的臨床應(yīng)用。circRNA進(jìn)行診斷的可靠性仍然需要大量的實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)結(jié)果及病例證明。此外，由于大量的circRNA，它們的功能復(fù)雜并且不同。目前的研究主要集中在RNA與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，但circRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的功能及其在DNA基因組中的作用仍然需不斷探索。

4 小 結(jié)

circRNA是近年來(lái)基因遺傳學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療與預(yù)防提供了新的研究思路，并且circRNA的高度組織特異性及穩(wěn)定性使其具備了作為新型生物標(biāo)志物的條件。大量研究結(jié)果表明circRNA在腫瘤中顯著表達(dá)，并且許多途徑可以影響腫瘤的發(fā)展。雖然已有許多研究證實(shí)了circRNA在生理和病理過(guò)程方面的生物學(xué)功能，以及circRNA在喉癌中扮演癌基因的功能，但是具體機(jī)制需要在今后的研究中進(jìn)一步揭示。然而，circRNA能否真正作為一個(gè)喉癌的分子標(biāo)志物，還需要更多大樣本的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，并且仍有很多的未知領(lǐng)域需要探索以及辨證，以便應(yīng)用于臨床。