蛋白質(zhì)中氨基酸外消旋化修飾的非特定位點(diǎn)分析方法研究進(jìn)展

王佳鳳，王生偉，李博**，狄斌

（1. 中國藥科大學(xué)藥物分析系，江蘇 南京 210009；2. 中國藥科大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；3. 南京市胸科醫(yī)院急診科，江蘇 南京210029）

1 外消旋化修飾簡述

蛋白質(zhì)是一種手性分子，其結(jié)構(gòu)由其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)所決定。除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都具有2 種手性形式，因而可能形成具有相同氨基酸序列的非對映異構(gòu)體蛋白。最初，生物學(xué)上認(rèn)為生物體只利用L-氨基酸來合成蛋白質(zhì)[1]。20 世紀(jì)40 年代起，在微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)含D-氨基酸多肽[2]，其中一些多肽是通過硫酯中間體[3]在多酶復(fù)合物上逐步組裝的。在20 世紀(jì)80 年代， Kreil 等[4]從南美樹蛙的皮膚分泌物中分離出了一種具有生物活性的D-氨基酸多肽。

蛋白質(zhì)的氨基酸外消旋化（amino acid racemization，AAR）指蛋白質(zhì)中至少1 個(gè)氨基酸殘基從L-氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-氨基酸，這是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）類型，通常用D-/L-氨基酸含量比值表示修飾程度[5]。AAR 可能會(huì)引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵、高級結(jié)構(gòu)等的變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性等物理和生化特征的改變[6-7]。蛋白質(zhì)的AAR 修飾研究對疾病生物標(biāo)志物的探尋、重大疾病發(fā)病機(jī)制的探索等均具有重要意義。

2 外消旋化修飾與疾病相關(guān)性

生物體內(nèi)AAR 修飾速率較慢[8]。在含有代謝穩(wěn)定的長壽蛋白質(zhì)的各種人類和動(dòng)物組織中，能夠發(fā)現(xiàn)AAR 修飾呈年齡依賴性。對不同年齡層次人群的椎間盤彈性蛋白（intervertebral disc，IVD)中天冬氨酸（Asp）的AAR 修飾進(jìn)行分析[9]，結(jié)果顯示彈性蛋白中D-Asp 與L-Asp 比值隨年齡增長呈升高趨勢，并推測IVD 中Asp 的AAR 修飾可能干擾彈性蛋白、膠原蛋白和蛋白聚糖分子的三級結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)椎間盤的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[10]。人大腦神經(jīng)纖維蛋白（Tau 蛋白）的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Tau 蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域中Asp265發(fā)生AAR 修飾[11]，人大腦中D-Asp 水平顯著增加可能使維持髓鞘結(jié)構(gòu)和白質(zhì)正常功能的蛋白失效[12]，導(dǎo)致大腦功能障礙或阿爾茨海默病（AD）。其他如晶狀體中的α-、β-晶體蛋白[13-14]也存在年齡依賴性的AAR 情況。

3 蛋白質(zhì)整體外消旋化修飾的分析方法

蛋白質(zhì)整體AAR 修飾水平一般通過水解后分析D-與L-氨基酸的比值來評價(jià)。通常提取分離目標(biāo)蛋白后，采用酸水解法將蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸，然后分析各氨基酸D-型與L-型的比值，從而判斷蛋白質(zhì)中各氨基酸AAR 修飾水平。

常用的分析手段包括液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）、毛細(xì)管電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS）、二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（2D-LC-MS）及核磁共振（NMR）技術(shù)等。LC-MS 法通常使用手性衍生化試劑將酸水解后的D-/L-氨基酸衍生化，得到互為非對映異構(gòu)體的衍生產(chǎn)物，在反相柱上分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。常用的手性衍生化試劑包括2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯（GITC）[15-16]等，一些新型衍生化試劑如琥珀酰亞胺基(4S)-(3-[（芐氧基）羰基]-5-氧代-1，3- 唑烷-4-基)乙酸酯[(S)-COXA-Osu]等[17]因具有質(zhì)譜兼容性好、生物基質(zhì)影響小等優(yōu)點(diǎn)而被用于AAR 修飾的分析。

CE-MS 法多數(shù)通過在電泳緩沖液中加入手性試劑從而實(shí)現(xiàn)D-/L-氨基酸的分離和AAR 修飾的測定，常用的手性選擇劑包括環(huán)糊精等[18]。同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道可使用異硫氰酸熒光素（FITC）結(jié)合毛細(xì)管電泳/激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)（CE/LIF）來對神經(jīng)肽的AAR 修飾進(jìn)行檢測[19]。

2D-LC-MS 法的優(yōu)勢在于可減小生物樣本基質(zhì)干擾，以叔丁基氨甲?？鼘帲╰BuCQN）手性柱和奎尼丁（tBuCQD）手性柱為一維和二維的色譜柱，由于這2 種固定相具有相似的化學(xué)選擇性和相反的手性結(jié)構(gòu)，對手性組分呈現(xiàn)反向洗脫順序，使其在一維和二維中的洗脫位置不同，而非手性組分在一維及二維色譜中洗脫位置不變，從而從目標(biāo)對映體的色譜空間中去除，避免與潛在干擾重疊[20]。

NMR 法是通過對含有（R）-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸的樣品溶液進(jìn)行1H-NMR 分析，對結(jié)果中1 個(gè)或多個(gè)質(zhì)子的光譜不等效性進(jìn)行比較，有效地實(shí)現(xiàn)氨基酸AAR 修飾的鑒別[21]。

上述這些方法可用于蛋白質(zhì)整體AAR 修飾水平的鑒定和測定，但一方面受到蛋白質(zhì)水解、衍生化過程中L-氨基酸向D-氨基酸轉(zhuǎn)化的干擾，另一方面僅能對蛋白質(zhì)中各氨基酸整體的AAR 修飾情況進(jìn)行鑒定，無法確定AAR 修飾位點(diǎn)，更難以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)活性中心等特定位點(diǎn)的AAR 修飾的分析[22]。

4 特定位點(diǎn)外消旋化修飾的分析方法

特定位點(diǎn)AAR 修飾分析方法可確定AAR 修飾位點(diǎn)，通常用于蛋白質(zhì)中活性中心或功能相關(guān)肽段中的AAR 修飾的定量檢測。常用的分離分析手段包括特異性酶解LC-MS 法、免疫分析法。

蛋白質(zhì)特異性酶解LC-MS 法是使用一些具有特異性識別位點(diǎn)的酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，得到包含目標(biāo)氨基酸的肽段，從而可對特定位點(diǎn)氨基酸AAR修飾進(jìn)行定量測定。天冬氨酸N 端內(nèi)切酶（Asp-N）僅識別L-α-Asp 殘基的N 端，蛋白異天冬氨酰甲基轉(zhuǎn)移酶（PIMT）只切割含有L-β-Asp 的肽段[23]，D-天冬氨酸內(nèi)切酶（paenidase）[24]只特異性識別D-α-Asp 殘基的N 端?，F(xiàn)已成功聯(lián)合應(yīng)用這3 種特異性識別D-/L-Asp 的商品化酶來鑒別晶狀體中Asp 的AAR 修飾情況[25]。但此方法由于酶的特異性，可能存在無法識別酶切位點(diǎn)，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，如D-天冬氨酸內(nèi)切酶無法特異性消化αBT10 肽段（αB-晶體蛋白中第93 至103 位的氨基酸序列），推測是由于D-天冬氨酸內(nèi)切酶具有序列特異性[25]；此外，商品化酶的使用成本較高，不適用于大量樣品的檢測分析[26]。

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）根據(jù)其抗體的序列特異性可確定AAR 位點(diǎn)并進(jìn)行定量測定。通過酶標(biāo)記的抗原-抗體反應(yīng)，通過吸光值檢測可對D-與L-Asp 的比值進(jìn)行檢測，但免疫學(xué)測定法需要分析物預(yù)選，目前商品化試劑盒種類較少[27]。

上述方法的反應(yīng)條件較溫和，操作中不易產(chǎn)生額外的AAR 修飾，能對蛋白質(zhì)活性中心或底物結(jié)合位點(diǎn)等功能相關(guān)位置的AAR 修飾情況進(jìn)行檢測，無需合成肽段，具有快速、低成本，以及工作量少等優(yōu)點(diǎn)[25]，可用于探究AAR 修飾對蛋白質(zhì)活性的影響。但這些方法大多以蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)或特定氨基酸為靶向，無法分析蛋白質(zhì)其他位點(diǎn)上的AAR修飾情況。

5 非特定位點(diǎn)外消旋化修飾的分析方法

為了更全面地探究體內(nèi)外AAR 修飾的規(guī)律，評價(jià)蛋白質(zhì)功能、闡明疾病發(fā)病機(jī)制，亟需一些普適的非特定位點(diǎn)AAR 修飾的分析方法，目前可應(yīng)用于非特定位點(diǎn)AAR 修飾測定的方法主要包括酶解LC-MS 法、氨肽酶（aminopeptidase，APM，EC 3.4.11.2）酶解法以及離子淌度質(zhì)譜法等。

5.1 酶解LC-MS 法

酶解LC-MS 法應(yīng)用于蛋白質(zhì)中非特定位點(diǎn)氨基酸的AAR 修飾測定，測定時(shí)主要采用胰蛋白酶（trypsin）對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，對酶解后的肽段進(jìn)行選擇性離子監(jiān)測（SIM）模式掃描分析，分析比較保留時(shí)間有差異但具有相同相對分子質(zhì)量的肽段的色譜峰，同時(shí)根據(jù)理論酶切位點(diǎn)合成對應(yīng)的D-/L-標(biāo)準(zhǔn)肽段，通過保留時(shí)間來對酶解結(jié)果進(jìn)一步確證，對其進(jìn)行鑒定及定量分析。

Takata 等[28]從人體晶狀體的水溶性部分中分離出βB2 晶體蛋白，用胰蛋白酶消化βB2 晶體蛋白后，使用Proteome Discover 1.0 軟件中的SEQUEST 算法進(jìn)行含Asp 肽的鑒定，然后進(jìn)行SIM，與合成得到的理論酶切片段的保留時(shí)間相比較來確認(rèn)βB2 晶體蛋白中Asp 的AAR 位點(diǎn)。結(jié)果顯示，人體老化晶狀體的βB2 晶體蛋白中存在多個(gè)AAR 位點(diǎn)，包括Asp4、Asp83、Asp92和Asp192，同時(shí)老年人晶狀體βB2 晶體蛋白中D-與L-Asp 的含量比值隨著年齡的增長而增長。

該方法采用的酶水解不會(huì)引起額外的AAR 修飾，能夠準(zhǔn)確定性及定量測定非特定位點(diǎn)AAR 修飾情況，方法不需要大量的樣品蛋白質(zhì)，無需復(fù)雜的提取純化過程，能夠從所有活組織和細(xì)胞中全面尋找受損或老化蛋白質(zhì)中的AAR 修飾位點(diǎn)[29]。但該方法需要合成對應(yīng)的酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜保留時(shí)間的確證，合成標(biāo)準(zhǔn)肽段較耗時(shí)[30]。

5.2 氨肽酶酶解法

APM 是一種膜結(jié)合外肽酶[31]，可以選擇性地從寡肽、酰胺和芳基酰胺衍生物N-末端切除L-氨基酸，主要是堿性和中性氨基酸，其中特別是對亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等氨基酸具有更高的選擇性和更快的水解速度[32]，大多數(shù)L-氨基酸多肽可在1 ～ 2 h 內(nèi)被消化。而在N-末端第2 個(gè)氨基酸位置上存在D-氨基酸或其他蛋白質(zhì)翻譯后修飾的多肽對APM 酶解具有抵抗性，這類含D-氨基酸多肽在數(shù)天的時(shí)間內(nèi)都能保持穩(wěn)定不被水解，其壽命是L-氨基酸多肽的10 倍以上。在研究中較常使用的APM包括亮氨酸APM、丙氨酸APM[33]等，APM 消化的敏感性與分子大小有關(guān)，當(dāng)?shù)孜餅樾‰臅r(shí)，其酶解更快速且高效[34]。

Ewing 等[35]使用APM 酶解加利福尼亞海兔心臟神經(jīng)肽，其L-氨基酸肽段被水解，含D-氨基酸的肽段被保留，課題組成功鑒別出心臟神經(jīng)肽中具有AAR 修飾的肽段NdWFA，通過合成標(biāo)準(zhǔn)肽段對發(fā)生AAR 修飾的肽段進(jìn)一步定量檢測。該方法降低了中樞神經(jīng)提取物的復(fù)雜性，不需要多肽對照品即可實(shí)現(xiàn)生物樣本中蛋白質(zhì)非特定位點(diǎn)AAR 修飾鑒定。Livnat 等[36]也使用APM 酶解法成功鑒別出加利福尼亞海兔神經(jīng)肽中另一發(fā)生氨基酸AAR 修飾的肽段GdFFD，同時(shí)使用氘代鹽酸對酶解后肽段進(jìn)行酸水解、用Marfey 試劑標(biāo)記以及液相色譜-質(zhì)譜法來驗(yàn)證D-氨基酸的存在，確定發(fā)生AAR 修飾的氨基酸種類，并對D-氨基酸進(jìn)行定量檢測。對加利福尼亞海兔腹腔神經(jīng)元中另一已知含D-氨基酸多肽的檢測結(jié)果也驗(yàn)證了該方法的可行性，證明其對篩選潛在的含D-氨基酸多肽有效。

APM 酶解法能夠成功鑒別蛋白質(zhì)中非特定位點(diǎn)AAR 修飾，其特殊的酶解選擇性可降低生物樣本檢測的復(fù)雜性，但也存在一定局限性，特定的N-末端殘基會(huì)增加對APM 酶解的抵抗力，例如，在N-末端帶有脯氨酸、谷氨酸的多肽可以抵抗APM 消化[35]，使這些多肽在較長一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，呈現(xiàn)假陽性結(jié)果。同時(shí)，當(dāng)AAR 修飾發(fā)生在肽段中間附近，或發(fā)生在C-末端附近，則APM 在酶解過程可能會(huì)忽略這個(gè)位點(diǎn)[37]，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，在這種情況下，可以對羧肽酶進(jìn)行研究，看其是否具備與APM 類似的選擇性酶切D-氨基酸的特性，為更全面研究AAR 修飾規(guī)律提供基礎(chǔ)[36]。

5.3 離子淌度質(zhì)譜法

離子淌度質(zhì)譜（ion mobility mass spectrometry，IM-MS）是離子淌度光譜與質(zhì)譜聯(lián)用的一種新型質(zhì)譜分析技術(shù)，其靈敏度高、檢測限低并具有實(shí)時(shí)檢測能力[38]。離子淌度質(zhì)譜分離原理主要是基于離子的大小和形狀的差異，離子受電場力作用向前運(yùn)動(dòng)，但不同離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞的截面不同，產(chǎn)生不同的阻力從而使其穿過漂移管所需的漂移時(shí)間存在差異[39]。較為常用的離子淌度質(zhì)譜有漂移時(shí)間離子遷移質(zhì)譜（DTIMS）、行波離子遷移質(zhì)譜（TWIMS）及場不對稱波形離子遷移質(zhì)譜（FAIMS）[40]這3 種。目前所使用的IM-MS 具備基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）或電噴霧離子源（ESI）等離子源，或四級桿質(zhì)譜和離子阱質(zhì)譜等質(zhì)量分析器串聯(lián)使用，從而提高檢測的分辨率和靈敏度[41]。

在對含D-/L-氨基酸的多肽進(jìn)行IM-MS 分析時(shí)，由于構(gòu)型不同，離子穿過漂移管時(shí)有先后順序[42]，D-/L-肽段的b/y 系列各碎片離子的檢出是IM-MS 法鑒定外消旋化修飾位點(diǎn)的前提。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)系使母離子與高壓高能惰性氣體（如He、N2等）發(fā)生反復(fù)碰撞，使分子積聚能量，當(dāng)達(dá)到一定能量閾值，化學(xué)鍵發(fā)生斷裂從而產(chǎn)生產(chǎn)物離子，但受肽段濃度、鏈長等因素的影響，其能提供的肽鏈信息有限[43]，特別是肽段帶有多電荷且肽鏈較長時(shí)序列組成較難分析，導(dǎo)致IM-MS 難以鑒定AAR 修飾位點(diǎn)。利用電子轉(zhuǎn)移裂解（ETD）技術(shù)[44]，將電子轉(zhuǎn)移至質(zhì)子化的肽段，可得到更全面的系列碎片離子并增強(qiáng)碎片響應(yīng)（S/N），便于后續(xù)IM-MS 測定，其裂解方式可以提供蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要序列信息，從而大幅度提高AAR 修飾檢測的覆蓋度和靈敏度，因此在蛋白質(zhì)組學(xué)、復(fù)雜化合物以及AAR分析方面顯示出特有的優(yōu)勢，逐漸在分析方面占據(jù)重要地位[45-46]。

Dwivedi 等[47]采用漂移時(shí)間離子遷移質(zhì)譜法（DTIM-MS），以(S)-(+)-2-丁醇為漂移氣體改進(jìn)劑，不同離子在漂移室中經(jīng)電場力作用，與漂移室中的中性氣體發(fā)生碰撞，各離子因結(jié)構(gòu)不同，受到的前進(jìn)阻力也有差異，因此穿過漂移室的時(shí)間也各不相同，從而得以分離。該方法成功分離了包括絲氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等在內(nèi)的多種物質(zhì)。Yu等[48]采用離子淌度遷移質(zhì)譜法研究了一些常見手性氨基酸，成功分離了色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及組氨酸，該方法對含芳香環(huán)、長鏈以及活性側(cè)鏈的氨基酸有顯著的手性分離能力，峰間分辨率高達(dá)1.826[49]。

Jeanne Dit Fouque 等[50]使用行波離子遷移質(zhì)譜法（TWIM-MS），其分離室中配備多個(gè)環(huán)形電極，相鄰電極上的電壓方向相反，從而形成如波浪般的電場壓力，不同離子在電場中的行進(jìn)速度不同，通過改變行波電場的移動(dòng)速度可以很好地分離皮啡肽1-4、啡肽Ⅰ、生長激素抑制素-14、γ-黑素細(xì)胞刺激素（γ-MSH）等D-氨基酸多肽。對于具有多電荷的大分子多肽，選擇監(jiān)測[M+2H]2+或[M+3H]3+離子能有更好的效果。我們已經(jīng)證明了該方法可以檢測到定量限小于0.25%的AAR 多肽，比文獻(xiàn)報(bào)道的其他LC-MS/MS 方法更好。分解AAR 多肽的碎裂模式可以識別具有多電荷的大分子多肽并進(jìn)一步降低檢測限和定量限，由于自由基驅(qū)動(dòng)的MS/MS 過程比碰撞誘導(dǎo)的解離提供更好的AAR 修飾識別，TWIM-ETD/ECD-MS 技術(shù)將推動(dòng)生物體中AAR 修飾分析的發(fā)展。Jia 等[51]采用TWIM-MS 法準(zhǔn)確測定了肽段中的D-氨基酸的AAR 位點(diǎn)，并將該方法應(yīng)用于高血糖激素中D-苯丙氨酸的AAR 檢測。

離子淌度質(zhì)譜法可以檢測常規(guī)質(zhì)譜法不能區(qū)分的復(fù)雜化合物或外消旋體等，同時(shí)與色譜分離方法相比，所需分析時(shí)間短，且該方法的樣品前處理步驟少，簡單易行，提高了AAR 修飾鑒定的效率，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢[52]，但D-/L-氨基酸肽段的IM-MS結(jié)果差異較小，生物樣品中的AAR 修飾檢測容易出現(xiàn)假陽性、假陰性的情況[53]。

6 結(jié)語

隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)中非特定位點(diǎn)氨基酸AAR 的研究已愈發(fā)多樣化，如何提高生物樣本非特定位點(diǎn)AAR 修飾檢測的準(zhǔn)確率，減少檢測結(jié)果的假陽性及假陰性情況，同時(shí)提高定量分析的重現(xiàn)性，是非特定位點(diǎn)AAR 修飾研究亟待解決的問題。建立更多高效簡便的非特定位點(diǎn)氨基酸AAR位點(diǎn)鑒別及定量檢測的評價(jià)方法，有助于更全面地研究體內(nèi)外AAR 修飾對蛋白質(zhì)生理功能的影響，也對闡明蛋白質(zhì)AAR 與重大疾病間的關(guān)系具有重要意義。