藥用大豆磷脂高含量組成物的拉曼光譜特征峰及其分析方法研究進(jìn)展

安遠(yuǎn)，陳峰，顧寧,*

（1. 東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與信息學(xué)院，江蘇 南京 211166）

大豆磷脂通常由磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）等組分構(gòu)成，在化妝品、食品、藥物與醫(yī)療保健品行業(yè)占有重要的地位[1]。隨著先進(jìn)藥物輸運(yùn)系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，基于磷脂分子等組裝體攜載治療成分甚至協(xié)同發(fā)揮作用的高端藥物研究也層出不窮[2-4]。

目前，基于拉曼光譜技術(shù)的大豆磷脂分析研究對(duì)象主要有PC 和PE。大豆磷脂中，PC 中含量較多的成分為二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1，2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine，DPPC，1）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC，2）、二油酰磷脂酰膽堿（1，2-dioleoyl-snglycero-3-phosphocholine，DOPC，3）和二亞油酰磷脂酰膽堿（1，2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DLPC，4）[5]；PE 中含量較多的成分為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE，5）和二油酰磷脂酰乙醇胺（1，2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine，DOPE，6）[6]。這 些組分的拉曼光譜及其特征峰已被獨(dú)立研究，且從不同方面對(duì)其特征峰的研究、分析已有相關(guān)報(bào)道。近年來，在藥物生產(chǎn)工藝中，與大豆磷脂的提取物相關(guān)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)對(duì)質(zhì)量控制的要求越來越高，而拉曼光譜分析可以有效滿足這些要求。本文對(duì)藥用大豆磷脂的拉曼光譜特征峰及其分析方法進(jìn)行歸納整理，有助于進(jìn)一步研究藥用磷脂的質(zhì)量控制及檢測(cè)方法。

1 大豆磷脂中磷脂酰膽堿的拉曼光譜特征峰

PC 的結(jié)構(gòu)由1 個(gè)親水的頭基和2 個(gè)疏水的?；湗?gòu)成。其中，頭基的頂端是1 個(gè)N 原子連接3 個(gè)甲基，疏水的酰基鏈由含C 鏈的棕櫚酰、硬脂酰、油酰、亞油酰等?；溄M成。

DPPC 的拉曼光譜特征峰集中分布于多個(gè)區(qū)間。715 cm-1附近的峰與DPPC 膽堿殘基中C-N鍵振動(dòng)相關(guān)[7]；1 000 ～ 1 200 cm-1為C-C 拉伸模式區(qū)域，可以基于分別代表偏轉(zhuǎn)構(gòu)象和反式構(gòu)象的1 090 和1 130 cm-1處特征峰的強(qiáng)度比值I1090/1130，解析不同濃度和溫度下DPPC烷基鏈構(gòu)象的信息[8]；1 200 ～1 600 cm-1為C-H 鍵變形密集的區(qū)域，主要的峰在1 157、1 184、1 300、1 440 和1 455 cm-1；1 733 cm-1附近的峰包含羰基拉伸振動(dòng)的信息[9]；2 080、2 090、2 100 和2 190 cm-1在通過氘原子取代DPPC 中H 原子的研究中提供了重要信息[10-12]；在2 800～3 100 cm-1的特征峰提供了烴鏈的C-H拉伸模式、DPPC 烷基鏈之間相互作用以及DPPC構(gòu)象相關(guān)的信息[8,13-14]，其中2 850 ～ 2 880 cm-1的特征峰對(duì)分子間振動(dòng)耦合敏感，因此對(duì)烴鏈的橫向堆積敏感[15]。

在文獻(xiàn)中提到的關(guān)于DPPC 特征峰比值的意義中，有幾個(gè)值得關(guān)注的部分。I1090/1130和I2844/2880代表了不同濃度和溫度下DPPC 烷基鏈構(gòu)象的信息[13]，同時(shí)也反映了脂質(zhì)的相態(tài)[16]；I2935/2880則代表了脂質(zhì)雙層的流動(dòng)程度[13,16]。

由于分子結(jié)構(gòu)的改變可以導(dǎo)致拉曼光譜特征峰的強(qiáng)度和位置發(fā)生變化，利用這種關(guān)系，可以分析新形成的化合物的結(jié)構(gòu)變化以及與其他結(jié)構(gòu)結(jié)合的位點(diǎn)。由DPPC 的拉曼光譜特征峰（見圖1）與其分子結(jié)構(gòu)可知，DPPC 頭部與其他結(jié)構(gòu)的結(jié)合情況以及構(gòu)象變化可反映在715、1 055、3 033 及3 042 cm-1的峰值處；2 條C 鏈的結(jié)構(gòu)變化體現(xiàn)在1 000 ～ 1 200 cm-1及1 733 cm-1的部分峰值處；DPPC 尾端的甲基的峰值和位置變化反映在1 455、2 847、2 938 cm-1等峰值處[7-20]。由于光譜峰值和分子的結(jié)構(gòu)存在直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系，我們假設(shè)二者存在一個(gè)函數(shù)關(guān)系，可以將結(jié)構(gòu)和光譜變化聯(lián)系在一起，通過計(jì)算光譜特征峰位置或積分面積的變化來研究化學(xué)反應(yīng)過程。

圖 1 DPPC 的拉曼光譜特征峰分布Figure 1 The peak distribution of DPPC

DSPC 的疏水部分為18 個(gè)C 的飽和脂肪?；湥鳧PPC 的疏水部分為16 個(gè)C 的飽和脂肪?；湥瑢?dǎo)致DSPC 在拉曼光譜上對(duì)于磷脂分子構(gòu)象敏感的C-C 振動(dòng)譜線（1 062、1 128 cm-1）與C-H 振動(dòng)譜 線（2 800、2 849、2 881、2 934 和2 962 cm-1）和DPPC 稍有差別。另一方面，由于2 種磷脂的極性頭部基團(tuán)相同，因此二者在拉曼光譜上對(duì)于磷脂頭部結(jié)構(gòu)敏感的PO2- 振動(dòng)（1 090 cm-1）等譜線無明顯差別[21-22]。

利用拉曼光譜研究DOPC 和DSPC、DPPC 結(jié)構(gòu)和構(gòu)象區(qū)別的譜線主要在3 個(gè)區(qū)域：C = C 鍵振動(dòng)區(qū)域（1 641、1 654、1 659、1 686 cm-1）、C-C 鍵 振動(dòng)區(qū)域（1 062、1 128 cm-1）和C-H 鍵振動(dòng)區(qū)域（2 800、2 849、2 881、2 934、2 962 cm-1）。C = C 鍵振動(dòng)區(qū)域主要給出結(jié)構(gòu)是否含有不飽和鏈的信息，用于區(qū)分混合物是否含有DOPC。C-C 鍵振動(dòng)區(qū)域和C-H 鍵振動(dòng)區(qū)域主要給出結(jié)構(gòu)中?；滈L(zhǎng)度的信息，可以將含16 個(gè)C 的?；湹慕Y(jié)構(gòu)（DPPC）和含18 個(gè)C 的?；湹慕Y(jié)構(gòu)（DSPC、DOPC）區(qū)分開[23-27]。

DLPC 中與C = O 鍵有關(guān)的特征峰分布在1 763 cm-1附 近；2 800～3 000 cm-1是CH2 和CH3 的C-H鍵拉伸振動(dòng)集中分布的區(qū)域，包括與CH2 振動(dòng)相關(guān)的特征峰（2 850、2 880、2 935 cm-1）以及與CH3 振動(dòng)相關(guān)的特征峰（2 895、2 935、2 962 cm-1）[8,25]。

DLPC 的?；湶伙柡统潭容^DOPC 更高。更高的不飽和程度使C = C 鍵振動(dòng)（1 655 cm-1）和與之相連的= C-H 鍵振動(dòng)（3 010 cm-1）的峰強(qiáng)度發(fā)生明顯變化。在DLPC 分子構(gòu)象改變導(dǎo)致流動(dòng)性和有序性發(fā)生變化時(shí)可以通過PO2- 相關(guān)的1 100、1 087 和1 076 cm-1的特征峰譜線來區(qū)分不同的DLPC 異構(gòu)體[8,28]。

2 大豆磷脂中磷脂酰乙醇胺的拉曼光譜特征峰

PE 和PC 的最大的區(qū)別在于，PC 的親水端頭基為膽堿殘基，而PE 的親水端頭基為乙醇胺殘基。

DSPE 親水頭部為一個(gè)膽堿殘基，不含甲基，因此光譜中代表C-N 鍵振動(dòng)的譜線（718、874 cm-1）[29]與磷脂酰膽堿的譜線（715、760、1 055 cm-1）有較大差別。DSPE 疏水部分為2 條18 個(gè)C的飽和脂肪?；湥@部分結(jié)構(gòu)體現(xiàn)在C-C 鍵振動(dòng)（1 062、1 100、1 130 cm-1）和CH2結(jié)構(gòu)C-H鍵振動(dòng)（1 295、1 456、2 846、2 881 cm-1）的譜線。反映DSPE 的C = O 鍵振動(dòng)的譜線出現(xiàn)在1 737 cm-1；在2 959 cm-1可以觀察到與末端甲基振動(dòng)相關(guān)的特征峰[29]。

DOPE 的疏水部分為含有一個(gè)C = C 鍵的不飽和脂肪?；?。與DSPE 相比，DOPE 存在C = C鍵振動(dòng)，該振動(dòng)反映在1 656 和3 006 cm-1的譜線處。DOPE 的C = O 鍵振動(dòng)主要體現(xiàn)在1 727 和1 744 cm-1譜線，對(duì)磷脂分子構(gòu)象敏感的CH2 的C-H 鍵振動(dòng)譜線出現(xiàn)在1 300、1 442、2 851、2 885 cm-1，?；溎┒薈H3的C-H 振動(dòng)反映在1 457、2 930、2 961 cm-1譜線處[30]。

3 磷脂結(jié)構(gòu)改變對(duì)拉曼光譜特征峰的影響

分子結(jié)構(gòu)的改變，以及與其他分子的相互作用都會(huì)影響拉曼光譜特征峰，可將變化的特征分為3類：親水頭部基團(tuán)的結(jié)構(gòu)變化引起的拉曼光譜特征峰變化；C 鏈與其他結(jié)構(gòu)相互作用引起的拉曼光譜特征峰變化；?；溎┒思谆c其他結(jié)構(gòu)相互作用引起的拉曼光譜特征峰變化。

二甲氧基姜黃素（dimethoxycurcumin，DiMC）與DPPC 相互作用時(shí)，在715 cm-1處峰的強(qiáng)度變化說明了DPPC 親水頭部基團(tuán)與DiMC 發(fā)生相互作用，使得結(jié)構(gòu)改變；拉曼光譜特征峰I2935/2880、I2844/2880和I1090/1130這3 個(gè)強(qiáng)度比代表DiMC 與烷基鏈的相互作用程度[7]。將發(fā)生相互作用前后的數(shù)據(jù)作圖進(jìn)行對(duì)比，利用其光譜結(jié)構(gòu)變化，可以得到不同鍵或不同原子的振動(dòng)情況。

通過DSPC 的密度泛函理論（density functional theory，DFT）計(jì)算可以得到部分拉曼光譜C-H振動(dòng)，其結(jié)果表明，在接近2 900 cm-1的峰值處，游離DSPC 分子的末端甲基的振動(dòng)強(qiáng)度高于配對(duì)DSPC 分子的末端甲基的振動(dòng)強(qiáng)度。由此說明，隨機(jī)堆積的DSPC 分子以及游離的DSPC 分子無序程度更高，而末端甲基振動(dòng)強(qiáng)度降低是由于DSPC 分子形成結(jié)晶相，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[31]。在實(shí)際應(yīng)用中，分子自身結(jié)構(gòu)的相互作用，在拉曼光譜的分析中也應(yīng)當(dāng)被考慮。不同的晶體結(jié)構(gòu)，會(huì)帶來拉曼光譜特征峰的一些變化。

Tantipolphan 等[29]通過物理混合、制粒、共沉淀、65℃加熱水合和單純120℃加熱5 種方法，制備卵磷脂和膽固醇的二元混合物，并研究其拉曼信號(hào)。各種制備方法得到的疏水區(qū)域拉曼特征峰，其光譜未見明顯差異。當(dāng)通過共沉淀、65℃加熱水合和單純120℃加熱制備樣品時(shí)，觀察到親水頭部甲基不對(duì)稱拉伸模式的拉曼光譜變化，說明這些樣品的頭部甲基發(fā)生了改變[29]。這項(xiàng)研究說明：物理混合等方法制備的磷脂-膽固醇混合物中沒有相互作用時(shí)，可以通過特征峰的代數(shù)和來判斷此類二元混合物的拉曼光譜特征峰變化。

4 大豆磷脂拉曼光譜數(shù)據(jù)處理分析方法

在關(guān)于藥用大豆磷脂高含量組成物的文獻(xiàn)中，最常用的分析方法是分析2 個(gè)拉曼光譜特征峰強(qiáng)度的比值[7,8,11,13,18,20,25,32]，通過將2 個(gè)鍵振動(dòng)的強(qiáng)度相比較來判斷2 個(gè)組分的比例，或者是2 種組分的結(jié)合情況。另外一種報(bào)道較多的是根據(jù)光譜隨溫度的變化來分析結(jié)構(gòu)改變對(duì)光譜造成的影響[25,27,29,33]，溫度改變會(huì)影響磷脂的結(jié)構(gòu)，使部分鍵振動(dòng)的拉曼光譜特征峰發(fā)生變化，甚至?xí)绊懙搅字M成物的相態(tài)。拉曼光譜隨樣品的濃度變化也是研究的重點(diǎn)之一[7,11,13,18,29]。

在對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理時(shí)，有文獻(xiàn)提到一些應(yīng)用較少但有一定參考價(jià)值的方法，例如通過減去背景噪聲來降低干擾[17-18]、將分析結(jié)果疊加在明場(chǎng)圖像[19,34]，以及通過DFT 計(jì)算來分析拉曼光譜特征峰的信息[31]等。

5 結(jié)語與展望

大豆磷脂提取物在藥物的制造過程中正扮演著越來越重要的角色，通過實(shí)時(shí)的技術(shù)手段分析大豆磷脂的組成成分是亟待進(jìn)一步研究的重要問題。拉曼光譜是研究分子組成及其結(jié)構(gòu)的一種重要手段，在當(dāng)前利用拉曼光譜進(jìn)行物質(zhì)分析的研究中，大多是對(duì)單一化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在磷脂的混合物分析方面，無相互作用以及含相互作用的多成分混合分析方法有待進(jìn)一步探索。深度學(xué)習(xí)有別于傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)專家系統(tǒng)，為復(fù)雜特征分析提供了更加有效的手段，因此，有望通過將拉曼光譜與深度學(xué)習(xí)結(jié)合，構(gòu)建混合物分析的理論基礎(chǔ)，對(duì)藥物制造過程中使用的大豆磷脂提取物進(jìn)行實(shí)時(shí)的組成分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)更加精確的質(zhì)量控制。我們期待在未來會(huì)有更多通過拉曼光譜對(duì)各類藥物進(jìn)行組成分析和質(zhì)量控制的研究報(bào)道。