角膜緣干細(xì)胞缺乏的臨床診斷及手術(shù)治療進(jìn)展

潘玉苗，楊燕寧

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心，武漢 430060)

角膜緣干細(xì)胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)是由于角膜上皮干細(xì)胞或前體細(xì)胞在數(shù)量上和(或)功能上的降低而導(dǎo)致角膜上皮正常動(dòng)態(tài)平衡不能維持的眼表疾病[1]。臨床上表現(xiàn)為角膜緣屏障功能受損，甚至角膜上皮的結(jié)膜化，最終可導(dǎo)致角膜盲。LSCD的準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要，因?yàn)檎_的診斷以及對(duì)角膜緣受累范圍的評(píng)估是制訂治療策略的基礎(chǔ)。以往對(duì)LSCD的診斷主要依據(jù)病史及臨床表現(xiàn)[2]，但是對(duì)于臨床體征的解釋存在一定的主觀性。隨著眼部成像技術(shù)及分子診斷標(biāo)志物的發(fā)展，LSCD的診斷進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)代。LSCD可單眼發(fā)病也可雙眼發(fā)病，受累的角膜緣干細(xì)胞可以是部分也可以是全周。部分LSCD可局限于角膜的一個(gè)或多個(gè)部分，當(dāng)中央角膜不受累時(shí)可采取保守治療策略；而對(duì)于全周LSCD無(wú)論是單側(cè)還是雙側(cè)，通過(guò)手術(shù)干預(yù)來(lái)替換受損或缺失的干細(xì)胞可能是目前唯一的治療方法[3]。在目前的幾種角膜緣干細(xì)胞移植技術(shù)中，自體角膜緣干細(xì)胞移植是最佳的方法，但供體組織的匱乏以及對(duì)自身健眼的損害使其發(fā)展受到一定限制?，F(xiàn)就LSCD的臨床診斷及手術(shù)治療進(jìn)展予以綜述。

1 LSCD的診斷方法

1.1傳統(tǒng)診斷方法

1.1.1臨床表現(xiàn)及裂隙燈顯微鏡檢查 LSCD患者的癥狀主要與角膜上皮愈合不良和復(fù)發(fā)性角膜上皮缺損相關(guān)，如眼紅、視力下降、畏光、異物感、流淚、眼瞼痙攣和疼痛等[1]，但這些癥狀均具非特異性，不足以明確診斷。LSCD的體征主要包括角膜上皮的結(jié)膜化、持續(xù)性或復(fù)發(fā)性上皮缺損、伴或不伴眼表新生血管及眼表炎癥以及瘢痕形成等，其中角膜上皮的結(jié)膜化是診斷最具特異性的指標(biāo)[4]。角膜上皮熒光素染色可見(jiàn)異常的上皮變薄甚至螺紋樣上皮改變，另外Vogt柵欄的丟失也是LSCD的一種表現(xiàn)，但角膜緣區(qū)域Vogt柵欄結(jié)構(gòu)差異較大，同一患者角膜緣的Vogt柵欄在上下角膜緣數(shù)量最多且顯著，在鼻側(cè)及顳側(cè)數(shù)量最少[5]，并且Vogt柵欄的丟失也與年齡有關(guān)[6]。因此，在診斷中缺乏一定的特異性。

1.1.2印跡細(xì)胞學(xué) 印跡細(xì)胞學(xué)是一種簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)的技術(shù)，可檢測(cè)角膜表面的杯狀細(xì)胞和結(jié)膜上皮細(xì)胞。角膜上存在結(jié)膜杯狀細(xì)胞是LSCD角膜上皮結(jié)膜化的有力證據(jù)，目前認(rèn)為是診斷LSCD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對(duì)于病變?cè)缙诨蚪Y(jié)膜化程度輕微者缺乏靈敏度[7]。此外，在某些眼表疾病晚期也會(huì)出現(xiàn)完全角化，如Steven′s Johnson綜合征患者結(jié)膜杯狀細(xì)胞可能完全缺失，通過(guò)印跡細(xì)胞學(xué)無(wú)法檢測(cè)到[8-9]。因此，陽(yáng)性印跡細(xì)胞學(xué)結(jié)果可以確診，而陰性結(jié)果不能排除該診斷。

1.2成像技術(shù)診斷方法

1.2.1體內(nèi)激光掃描共聚焦顯微鏡(in vivo laser scanning confocal microscopy，IVCM) IVCM可在細(xì)胞水平觀察LSCD患者角膜及角膜緣的微觀結(jié)構(gòu)改變。Vogt柵欄早期呈輕度形態(tài)改變，晚期結(jié)構(gòu)完全消失[10]。角膜上皮結(jié)膜化的表現(xiàn)是角膜上出現(xiàn)杯狀細(xì)胞，但目前對(duì)杯狀細(xì)胞形態(tài)特征的認(rèn)識(shí)還存在爭(zhēng)議，一些報(bào)道認(rèn)為杯狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈高反射性[11-12]，也有研究認(rèn)為呈低反射性[13]，造成此現(xiàn)象的原因可能與杯狀細(xì)胞的分泌狀態(tài)不同有關(guān)。在LSCD的診斷方面，IVCM與印跡細(xì)胞學(xué)診斷具有較高的一致性(90%)(Kappa=0.85)[12]。近年來(lái)，隨著成像技術(shù)的發(fā)展，已有研究利用IVCM評(píng)估LSCD的嚴(yán)重程度，如在LSCD早、中期，上皮基底細(xì)胞密度和基底神經(jīng)密度顯著減小，而晚期正?；准?xì)胞形態(tài)完全喪失，基底神經(jīng)不可見(jiàn)[10]。亦有研究利用IVCM早期診斷以及角膜上皮及角膜緣微結(jié)構(gòu)的改變來(lái)監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IVCM上LSCD的微觀結(jié)構(gòu)改變要早于臨床表現(xiàn)，且基底細(xì)胞密度降低程度、中央?yún)^(qū)角膜上皮和角膜緣上皮變薄程度均與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14-15]。目前已有學(xué)者基于臨床表現(xiàn)及IVCM觀察提出了新的LSCD臨床評(píng)分系統(tǒng)[16]，有望對(duì)LSCD進(jìn)行準(zhǔn)確的臨床分期，便于監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展及治療。

1.2.2前段光學(xué)相干斷層掃描(anterior segment-optical coherence tomography，AS-OCT) AS-OCT是一種快速、簡(jiǎn)便、非接觸式的角膜成像技術(shù)，主要用于分析各種眼表疾病角膜上皮厚度變化。超高分辨的AS-OCT使角膜緣的Vogt柵欄、血管、淋巴管和神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)可視化，協(xié)助LSCD病情評(píng)估，同時(shí)使角膜緣干細(xì)胞移植取材更具針對(duì)性[17-18]。有研究表明，AS-OCT上LSCD患者受累區(qū)域角膜及角膜緣上皮變薄，且上皮變薄程度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[19]，同時(shí)也可看到Vogt柵欄及角膜緣隱窩消失[1,20]，但同樣存在年齡和檢查部位的差異。此外，隨著OCT技術(shù)的發(fā)展，血管造影技術(shù)使得角膜-鞏膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)可視化，可評(píng)估LSCD角膜新生血管形成[21-22]。由于角膜新生血管不是LSCD的特異性征象，OCT血管造影在LSCD診斷中的應(yīng)用價(jià)值有限，但它可能是量化LSCD角膜新血管形成的重要工具。

1.3分子生物學(xué)技術(shù)診斷方法 細(xì)胞角蛋白(cytokeratins，CK)是一組細(xì)胞骨架蛋白，可在上皮細(xì)胞中形成中間絲，并在上皮發(fā)育和分化過(guò)程中以不同的形式表達(dá)。CK19是結(jié)膜上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，印跡細(xì)胞學(xué)CK19陽(yáng)性被認(rèn)為是角膜上皮結(jié)膜化的依據(jù)，曾被用于LSCD的診斷，但CK19在角膜緣和外周角膜上皮中也有表達(dá)[23]，因此需進(jìn)一步研究CK19在診斷中的特異性。CK12被認(rèn)為是角膜上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，且可用于評(píng)估LSCD的嚴(yán)重程度，CK12陽(yáng)性提示輕度LSCD，CK12陰性提示重度LSCD[24]。其他標(biāo)志物(CK7[25]、CK13[24,26]、黏蛋白1[27]和黏蛋白5AC[23,28]等)也可用于LSCD的輔助診斷。

檢測(cè)CK的傳統(tǒng)技術(shù)為免疫組織化學(xué)染色。然而研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)黏蛋白5AC轉(zhuǎn)錄物較免疫組織化學(xué)染色更客觀[28]。此外，還有學(xué)者應(yīng)用高效液相色譜法、二維電泳以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)先天性無(wú)虹膜患者的淚液進(jìn)行蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子分析[29-30]。與印跡細(xì)胞學(xué)相比，淚液采集更容易且對(duì)上皮損傷較小，但先天性無(wú)虹膜患者僅占LSCD病因很小的一部分，因此其診斷價(jià)值有限。結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物以及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步提高了傳統(tǒng)印跡細(xì)胞學(xué)的靈敏度和特異度，結(jié)合分子生物學(xué)和體內(nèi)成像，LSCD的診斷將更加可靠。

2 LSCD的手術(shù)治療

2.1羊膜移植 羊膜雖不提供干細(xì)胞，但能促進(jìn)殘留干細(xì)胞的增殖和遷移，有助于角膜的修復(fù)、改善視力，減輕疼痛和畏光等癥狀，對(duì)于部分LSCD患者療效顯著。研究表明，將羊膜作為臨時(shí)補(bǔ)片用于角膜緣干細(xì)胞的急性損傷，可減少瘢痕形成和角膜渾濁，降低LSCD進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[31-33]。羊膜移植與傳統(tǒng)手術(shù)結(jié)合可提高手術(shù)成功率，如聯(lián)合角膜清創(chuàng)和各種類(lèi)型的角膜緣上皮移植術(shù)等均取得了良好的療效[34]。

2.2角膜緣上皮干細(xì)胞移植

2.2.1自體結(jié)膜角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)(conjunctival limbal autograft，CLAU) 由于CLAU取材于自身對(duì)側(cè)眼，不存在免疫排斥且移植成功率較高，故目前仍是單側(cè)LSCD的首選術(shù)式。有研究顯示，CLAU的短期和中期隨訪手術(shù)成功率為80%～100%，且視力提高25%～100%[35]。長(zhǎng)期隨訪顯示，術(shù)后3年和術(shù)后6年的成功率分別為76%和62%[36]。Baradaran-Rafii等[37]回顧分析了34例單側(cè)LSCD患者CLAU術(shù)后的病例資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLAU常見(jiàn)的術(shù)后并發(fā)癥與植片(大小、厚度、位置和排列)及慢性眼表暴露有關(guān)。上皮延遲愈合和持續(xù)性的上皮缺損是術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥。但關(guān)于植片的最佳尺寸尚未達(dá)成共識(shí)，經(jīng)典的植片大小為兩個(gè)60°的植片，目前認(rèn)為<180°的植片對(duì)供眼不會(huì)造成影響，過(guò)小的植片會(huì)影響手術(shù)成功率[38]。Baradaran-Rafii等[39]報(bào)道了5例采用單一植片取材范圍60°的CLAU，結(jié)果顯示，5例患者均出現(xiàn)持續(xù)角膜上皮缺損，其中2例患者出現(xiàn)角膜穿孔。雖然CLAU是比較可靠且成熟的手術(shù)方式，但仍有造成對(duì)側(cè)眼損傷的風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)重視術(shù)前對(duì)側(cè)眼的評(píng)估及術(shù)后并發(fā)癥的預(yù)防。

2.2.2同種異體結(jié)膜角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)(conjunctival limbal allograft，CLAL) CLAL取材可來(lái)源于健在親屬或死亡供體，植片取材與CLAU相同。CLAL可用于雙側(cè)LSCD的治療，但由于免疫反應(yīng)和同種異體移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)，影響了CLAL的成功率[40]。有研究采用組織相容性抗原供體-受體匹配、全身免疫制劑、術(shù)中取材時(shí)使用環(huán)磷酰胺取結(jié)膜緣移植物以及用纖維蛋白膠固定移植物等方法降低了免疫和排斥反應(yīng)[41-42]，但移植失敗也可能與LSCD的病因相關(guān)[43]。

2.2.3環(huán)形同種異體角膜緣移植術(shù)(keratolimbal allograft，KLAL) KLAL主要取材于新鮮尸體，植片由兩個(gè)半環(huán)的板層、小部分鞏膜、全角膜緣以及周邊透明角膜部分組成，不包括結(jié)膜，可提供大量的干細(xì)胞用于單側(cè)或雙側(cè)LSCD。由于KLAL不提供結(jié)膜組織，更適用于先天性無(wú)虹膜、接觸鏡相關(guān)以及醫(yī)源性等LSCD。伴有結(jié)膜受損的LSCD可采用改良的新技術(shù)，即KLAL聯(lián)合CLAL[44]。急性免疫排斥反應(yīng)是KLAL最常見(jiàn)的術(shù)后并發(fā)癥，故KLAL術(shù)后患者需要使用全身免疫抑制劑以減輕免疫排斥反應(yīng)和慢性炎癥[45]。

2.2.4離體培養(yǎng)的角膜緣上皮干細(xì)胞移植(cultured limbal epithelial transplantation，CLET) CLET取大小為1 mm×2 mm的角膜緣組織進(jìn)行離體培養(yǎng)后移植到病變角膜上，取材可取自體對(duì)側(cè)健眼、活體親屬眼或新鮮尸眼。CLET取材所需的供體細(xì)胞數(shù)量較少，降低了供眼患LSCD風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)合移植物培養(yǎng)中缺乏朗格漢斯細(xì)胞，可降低免疫排斥反應(yīng)[40]。CLET的缺點(diǎn)為目前離體細(xì)胞的培養(yǎng)主要為組織塊培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境和較高的硬件設(shè)施使得成本增加，而培養(yǎng)基使用的動(dòng)物衍生品等增加了人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)，且該方法不能提供結(jié)膜組織，有嚴(yán)重結(jié)膜疾病的患者不能從中受益[40,46]。近年研究表明，CLET術(shù)后總體成功率約為70%，且自體移植物和同種異體移植物的CLET差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[47-48]。已報(bào)道的CLET術(shù)后并發(fā)癥包括移植物下出血、感染性角膜炎、皰疹病毒性角膜炎、排斥反應(yīng)、青光眼、持續(xù)性上皮缺損、角膜穿孔以及環(huán)孢素相關(guān)的不良反應(yīng)等[40,48-50]。

2.2.5其他來(lái)源的黏膜上皮細(xì)胞移植 目前對(duì)雙側(cè)LSCD的治療仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。為了解決供體組織匱乏的問(wèn)題，已有研究尋找其他來(lái)源的干細(xì)胞用于眼表重建，其中體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植已被證明是安全、有效的替代品，成功率高達(dá)80%[51-52]。體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植失敗主要與持續(xù)的角膜上皮缺損、角膜表面新生血管形成以及角膜表面的纖維化有關(guān)[53]。Bardag-Gorce等[54]報(bào)道，術(shù)后發(fā)生角膜表面新生血管生成可能是由于缺乏抗血管生成因子。但目前對(duì)于術(shù)后新生血管生成的具體機(jī)制尚不清楚。此外，人體胚胎干細(xì)胞、皮膚表皮干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和未成熟牙髓干細(xì)胞等其他細(xì)胞來(lái)源正在研究中[55]，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明它們?cè)贚SCD中的功效。

2.2.6單純角膜緣上皮移植術(shù)(simple limbal epithelial transplantation，SLET) 2012年，Sangwan等[56]提出應(yīng)用SLET治療單側(cè)LSCD，從健康眼睛獲得2 mm×2 mm角膜緣組織并分成8～10個(gè)小塊保存于平衡鹽溶液中，然后360°環(huán)形剪開(kāi)球結(jié)膜，去除角膜表面的新生血管及結(jié)膜上皮，將新鮮羊膜置于角膜上，并通過(guò)纖維蛋白膠將移植物均勻地分布在新鮮羊膜上，最后表面覆以繃帶鏡，該技術(shù)需要的角膜緣組織非常少，降低了CLAU供體眼LSCD的風(fēng)險(xiǎn)，成功率較高。Amescua等[57]用冷凍保存的羊膜改進(jìn)了SLET方法，他們將角膜緣組織置于雙層羊膜之間，為干細(xì)胞增殖建立胚胎時(shí)期的微環(huán)境，稱(chēng)之為“夾心技術(shù)”，術(shù)后移植成功率達(dá)100%，且術(shù)中及術(shù)后隨訪期間未見(jiàn)明顯并發(fā)癥，視力也均有所提高。Vazirani等[58]的多中心研究顯示，自體SLET成功率高達(dá)80%，兩行視力提高率約為65%。Basu等[59]的單中心研究報(bào)道了對(duì)125例單側(cè)LSCD患者行自體SLET平均隨訪1.5年的結(jié)果，成功率為76%，兩行視力提高率為75%。Arora等[60]的前瞻性研究比較了SLET和CLAU，兩者在眼表重建的成功率均為100%，且兩者在眼表重建及視力改善方面療效相當(dāng)。在已報(bào)道的受體眼的并發(fā)癥中局部LSCD復(fù)發(fā)最常見(jiàn)，在不影響視軸的情況下可密切觀察，必要時(shí)行手術(shù)干預(yù)；其他并發(fā)癥還包括角膜結(jié)膜化進(jìn)一步進(jìn)展、瞼球粘連、羊膜下出血、植片與羊膜間的不粘連移位、無(wú)菌性或細(xì)菌性角膜炎、角膜新生血管的復(fù)發(fā)、持續(xù)性角膜上皮缺損以及角膜上皮過(guò)度增生等，可行相應(yīng)的對(duì)癥處理[50,58- 59,61-62]。雖然大多數(shù)報(bào)道SLET用于單眼疾病，且主要是自體來(lái)源的SLET，不需要免疫抑制劑，但Bhalekar等[63]報(bào)道了異體來(lái)源的SLET也可治療雙側(cè)LSCD，雖然術(shù)后3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)了同種異體移植物排斥反應(yīng)，但予以局部及全身激素治療后好轉(zhuǎn)，研究強(qiáng)調(diào)了異體來(lái)源的SLET需持續(xù)使用免疫抑制劑。可見(jiàn)，SLET為角膜盲病例提供了實(shí)用的解決方案，特別是在離體擴(kuò)增技術(shù)不實(shí)用的地區(qū)。

3 小 結(jié)

眼部成像技術(shù)及分子標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展使人們對(duì)角膜及角膜緣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，同時(shí)提高了對(duì)LSCD的精確診斷。建立LSCD發(fā)生閾、對(duì)LSCD的嚴(yán)重程度進(jìn)行分層仍處于臨床研究中。目前尚未確定角膜緣上皮干細(xì)胞的特定分子標(biāo)志物。近年來(lái)，在供體來(lái)源相對(duì)匱乏的情況下，培養(yǎng)的角膜緣上皮干細(xì)胞移植顯示了良好的應(yīng)用前景。但培養(yǎng)后的角膜干細(xì)胞的分化、生理生化的變化以及異體移植后如何降低排斥反應(yīng)等一系列問(wèn)題均亟待解決?？傊?，隨著培養(yǎng)和擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展以及支架和基質(zhì)的改進(jìn)，新一代干細(xì)胞技術(shù)將用于臨床以最終解決LSCD的問(wèn)題。