單細(xì)胞RNA測序在間充質(zhì)干細(xì)胞研究中的應(yīng)用

龍 笑 李竹君

1970年，F(xiàn)riedenstein等[1]在豚鼠的骨髓和脾臟中發(fā)現(xiàn)了可以在體外形成成纖維細(xì)胞群落、在體內(nèi)形成異位骨組織的骨祖細(xì)胞。對該類細(xì)胞的進(jìn)一步研究顯示，它們能夠以未分化的狀態(tài)復(fù)制，并具有分化形成多種間充質(zhì)組織的潛能，包括骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓，屬于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)[2]。MSCs是成體干細(xì)胞，存在于骨髓、脂肪等多種組織中。國際細(xì)胞治療聯(lián)合會(International Society for Cellular Therapy, ISCT)提出的體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞表型為：≥95%細(xì)胞表達(dá)包括CD105、CD73和CD90在內(nèi)的標(biāo)志物，≤2%細(xì)胞表達(dá)包括CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19、CD79A以及HLA-DR19[3]。對MSCs的深入研究顯示，其具有修復(fù)組織損傷、通過分泌可溶性因子調(diào)節(jié)組織微環(huán)境、調(diào)節(jié)免疫等作用，引起了研究者將其用于干細(xì)胞療法的興趣[4～6]。MSCs在脂肪組織中含量較高，獲取方便，加之倫理學(xué)問題少、免疫反應(yīng)弱等優(yōu)點，極具應(yīng)用前景。截至2020年2月，在Clinicaltrials.gov網(wǎng)站檢索Mesenchymal stem cells，可以找到1044條已完成或正在進(jìn)行的間充質(zhì)干細(xì)胞療法的臨床試驗。目前，MSCs主要用于脆弱組織的修復(fù)重建，包括肌肉骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、肝臟、角膜、氣管、皮膚等[7]。

但是，體外培養(yǎng)的MSCs具有高度異質(zhì)性及表型不穩(wěn)定性[8]。來自不同個體、不同組織種類的MSCs具有不同的表型和性質(zhì)。1999年，Phinney等[9]在小鼠中觀察到，不同個體骨髓中MSCs含量差異可達(dá)10倍，在成骨分化標(biāo)志物堿性磷酸酶的表達(dá)水平、生長速率、表面標(biāo)志物等方面也具有較大差異。隨后，他們又觀察了取自17名健康志愿者髂后上棘的人骨髓MSCs，發(fā)現(xiàn)其生長速率差異可達(dá)12倍[10]。由于MSCs的異質(zhì)性和分離技術(shù)上的差異，如果應(yīng)用于大規(guī)模臨床治療，效果可能參差不齊[11]。這一點大大阻礙了對它的研究和應(yīng)用。

單細(xì)胞RNA測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技術(shù)是打破這一困境的絕佳工具。2009年，Tang等[12]采用顯微鏡下手動分離單個細(xì)胞的方法，在二代測序的基礎(chǔ)上進(jìn)行了第1例單細(xì)胞RNA測序。大體來說，目前單細(xì)胞RNA測序的操作包含4個步驟：①單個細(xì)胞的分離、捕獲；②反轉(zhuǎn)錄；③cDNA擴(kuò)增；④測序文庫的構(gòu)建。通過給每個細(xì)胞加上獨特的識別碼，實現(xiàn)針對單個細(xì)胞進(jìn)行測序，可以從根本上解決困擾研究者的異質(zhì)性問題。結(jié)合生物信息學(xué)分析等研究方法，單細(xì)胞RNA測序為多個領(lǐng)域的研究帶來新的契機(jī)。近年來，它被應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類群、動態(tài)觀察發(fā)育過程、研究基因調(diào)控機(jī)制、觀察隨機(jī)等位基因表達(dá)等多個方面的研究[13]。且隨著技術(shù)的進(jìn)步，單細(xì)胞RNA測序逐漸從技術(shù)和價格上變得更加普及，研究者無需再過多關(guān)注測序方法，而可以將目光聚焦于生物學(xué)問題本身。本文將總結(jié)自單細(xì)胞RNA測序技術(shù)誕生以來在間充質(zhì)干細(xì)胞研究中的應(yīng)用，并展望其前景。

一、繪制細(xì)胞圖譜、鑒定細(xì)胞亞群

單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)包含樣本中每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，可以用于了解樣本中細(xì)胞的基本信息，如根據(jù)算法進(jìn)行分群、鑒別不同亞群的標(biāo)志物、研究差異表達(dá)基因的功能及通路等，并作為參照數(shù)據(jù)庫，供之后的研究進(jìn)行比對分析。Freeman等[14]于2015年對小鼠骨髓MSCs進(jìn)行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)多能性相關(guān)基因在骨髓MSCs單細(xì)胞之間的表達(dá)水平基本一致，但與成骨、成軟骨、成脂、神經(jīng)及血管平滑肌分化相關(guān)的基因表達(dá)水平卻具有顯著差異，免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)也不一致。該研究證實了MSCs的譜系分化預(yù)備，也提示將MSCs應(yīng)用于臨床時應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎小心——細(xì)胞間的異質(zhì)性會導(dǎo)致治療效果的不確定性。Liu等[15]2018年對來自3名供者的24358個離體培養(yǎng)的脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，建立了ADSCs的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，這對于研究ADSCs的異質(zhì)性和譜系分化預(yù)備均有重要參考價值，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

二、觀察MSCs的譜系層級

MSCs并不是單一、靜止的干細(xì)胞群，而是分散于分化軌跡中不同位置的異質(zhì)性細(xì)胞集群——從具有多能性的干細(xì)胞逐漸分化為組織細(xì)胞。Merrick等[16]通過對人類和小鼠脂肪間充質(zhì)祖細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)群體中存在不同亞群，結(jié)合體內(nèi)外功能試驗，定義了間充質(zhì)祖細(xì)胞的譜系層級：由二肽基肽酶-4 (DPP4) 標(biāo)記的細(xì)胞是高度增殖的多能祖細(xì)胞，較不易分化為脂肪細(xì)胞；細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM1)標(biāo)記的細(xì)胞為脂肪前體細(xì)胞，輕微誘導(dǎo)即可分化為脂肪細(xì)胞；CD142+細(xì)胞與ICAM1+細(xì)胞相似。體內(nèi)試驗顯示，DPP4+細(xì)胞首先分化為ICAM1+/CD142+的脂肪前體細(xì)胞，再分化為脂肪細(xì)胞。由于間充質(zhì)祖細(xì)胞分化介導(dǎo)的增生性生長(脂肪生成)對于脂肪組織的正常功能至關(guān)重要，該過程缺陷會導(dǎo)致脂肪纖維化和炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗，因此，靶向上述分子促進(jìn)間充質(zhì)祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化或許能夠改善代謝疾病。

Wolock等[17]對小鼠骨髓中的非造血細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，定義了非造血細(xì)胞的分群；結(jié)合計算模擬和細(xì)胞狀態(tài)層級，可以繪制出從間充質(zhì)細(xì)胞到骨、軟骨和脂肪的分化軌跡，并確定各條軌跡中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

三、細(xì)胞譜系之間的差異比較

比較不同來源、不同狀態(tài)的MSCs，或?qū)SCs與其他細(xì)胞譜系比較，有助于深入理解細(xì)胞特性的差異及其背后的機(jī)制，例如根據(jù)治療需要選擇具有不同特性的細(xì)胞系，指導(dǎo)臨床應(yīng)用。Barrett等[18]通過單細(xì)胞RNA測序比較華通膠和骨髓來源的MSCs，發(fā)現(xiàn)436個差異表達(dá)基因參與免疫調(diào)節(jié)、血管生成、創(chuàng)傷愈合、凋亡、抗腫瘤活性和趨化作用等過程。其中，華通膠來源的MSCs中免疫分子的表達(dá)顯著高于骨髓MSCs。Zhou等[19]比較了人脂肪和骨髓來源MSCs的單細(xì)胞測序資料，和兩種細(xì)胞在臨床應(yīng)用上的特性。測序揭示了以下不同點：脂肪來源的MSCs比骨髓來源的MSCs異質(zhì)性更低，更不依賴于線粒體呼吸產(chǎn)生能量，表達(dá)HLA-Ⅰ類抗原水平更低，免疫抑制作用更強(qiáng)。在治療骨關(guān)節(jié)炎方面，脂肪來源的MSCs療效更加穩(wěn)定。Zhao等[20]比較了胚胎和成體骨髓MSCs，發(fā)現(xiàn)二者具有很大差異。通過分析差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)成體骨髓MSCs表現(xiàn)出更活躍的血管分化和細(xì)胞運動。由此可以推測，在血管相關(guān)領(lǐng)域，成體骨髓MSCs的應(yīng)用潛力更大。

Sisakhtnezhad等[21]使用單細(xì)胞RNA測序比較小鼠精原干細(xì)胞與MSCs的差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，以MSCs為對照，找到了精子發(fā)生過程、細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換中的重要因子。Xiao等[22]通過比較無菌小鼠和無特定病原體小鼠的骨髓MSCs，發(fā)現(xiàn)菌群對于干性的維持有重要作用；將無特定病原體小鼠的菌群移植給無菌小鼠，則其骨髓MSCs的增殖和分化能力恢復(fù)正常；菌群還通過誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡和分泌細(xì)胞因子維持骨髓MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能。

四、觀察MSCs的組織分布與作用

越來越多的組織中發(fā)現(xiàn)了MSCs的存在。單細(xì)胞RNA測序可以發(fā)現(xiàn)組織中新的細(xì)胞類群，包括MSCs，并進(jìn)一步分出亞群；通過生物信息學(xué)方法分析各亞群高表達(dá)基因參與的通路、生物學(xué)過程等，可以推測MSCs參與了哪些生物學(xué)過程及其機(jī)制。

Liu等[23]對妊娠早期和中期的人胎盤進(jìn)行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)其中除了已知的多種細(xì)胞及其新亞群，還有間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。Shafiee等[24]研究發(fā)現(xiàn)人類足月胎盤中存在中內(nèi)皮雙能祖細(xì)胞，在體外可分化為內(nèi)皮組織和間充質(zhì)組織，且向間充質(zhì)分化的過程不受經(jīng)典的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化因子TGF-β通路的調(diào)控。Kameishi等[25]在角膜緣上皮組織中通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，至少有兩群細(xì)胞的表型類似不成熟的上皮/間充質(zhì)組織細(xì)胞，為傳統(tǒng)認(rèn)識的角膜上皮干細(xì)胞中新的亞群。有研究者對體外傳代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記，且能夠被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，說明該細(xì)胞符合ISCT提出的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，可以被稱為間充質(zhì)干細(xì)胞。

Gu等[26]對血管旁脂肪組織進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，且其中一個亞群表達(dá)與平滑肌分化相關(guān)的重要通路，這說明間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過分化為血管平滑肌細(xì)胞來維持血管的生理功能。對小鼠靜脈移植模型進(jìn)行MSCs移植，可以觀察到MSCs通過平滑肌分化對血管重塑的作用，且分化過程受到TGF-β1和miR-378a-3p的調(diào)控。

牙泡中存在間充質(zhì)祖細(xì)胞，它們參與形成根骨界面，并通過自分泌/旁分泌的甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)及其受體調(diào)節(jié)牙齒萌出的過程[27]。Takahashi等[27]通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，牙泡細(xì)胞中PTHrP+的亞群也表達(dá)高水平的PTH/PTHrP受體(PPR)，結(jié)合細(xì)胞譜系分析等方法，得出牙泡中的間充質(zhì)祖細(xì)胞通過PTHrP及其受體的自分泌/旁分泌途徑維持自身的生理功能和細(xì)胞命運的結(jié)論。

Kayaba等[28]通過共培養(yǎng)等試驗發(fā)現(xiàn)骨髓中PDGFRα+Sca-1+間充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)漿細(xì)胞存活并分泌抗體的作用，為推測其中可能的分子和通路進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)PDGFRα+Sca-1+間充質(zhì)干細(xì)胞具有異質(zhì)性，其中一群細(xì)胞表達(dá)Vcam1、Nes和IL-6等與漿細(xì)胞和造血干細(xì)胞密切關(guān)聯(lián)的基因，ELISA證實，PDGFRα+Sca-1+間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌IL-6。

五、觀察MSCs的誘導(dǎo)分化過程

MSCs在合適的誘導(dǎo)條件下，可以分化為間充質(zhì)以外的組織，是再生醫(yī)學(xué)，尤其是組織工程中極具應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。Li等[29]從人脂肪組織中獲取了一種新的MSCs，并將其誘導(dǎo)為有功能的肝細(xì)胞，使用單細(xì)胞RNA測序觀察分化過程中基因表達(dá)譜的變化。不同于以往報道的MSCs，這種新的類群處于常染色質(zhì)狀態(tài)，具有表觀遺傳多能性，并表達(dá)多能性標(biāo)志物MYC、KLF4和GMNN?；虮倔w分析顯示，MSCs分化為肝細(xì)胞全程中的事件中，如KLF4和GMNN等多能性相關(guān)基因的表達(dá)水平逐漸降低直至消失，而血管生成、膠原纖維合成等基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，肝臟發(fā)育的關(guān)鍵基因ATF5于誘導(dǎo)后3天開始表達(dá)。誘導(dǎo)后5～9天之間基因表達(dá)的變化最大，與肝細(xì)胞譜系特化有關(guān)；9～13天時，與肝細(xì)胞功能相關(guān)的基因，如脂質(zhì)運輸、維生素代謝、脂質(zhì)合成、膽固醇調(diào)節(jié)等相關(guān)基因的表達(dá)開始上調(diào)。該研究將單細(xì)胞RNA測序應(yīng)用于MSCs分化的過程中，揭示了細(xì)胞發(fā)育和轉(zhuǎn)換中的變化和機(jī)制。

六、展 望

單細(xì)胞RNA測序技術(shù)的誕生與不斷革新使得分析復(fù)雜樣本中千萬余單個的細(xì)胞成為可能。不斷有更加靈敏、更加自動化的方法和技術(shù)產(chǎn)生，使研究者可以用更短時間獲得更多更加精確的數(shù)據(jù)。單細(xì)胞RNA測序?qū)⒕忍嵘?，以生命活動的基本單位——?xì)胞為單位來分析，可以避免單個細(xì)胞的特征被掩蓋，觀察到細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與環(huán)境之間的復(fù)雜交流等多種重要的信息。該技術(shù)在多個領(lǐng)域的應(yīng)用將產(chǎn)生一大批對未來具有極大影響的知識，如腫瘤、免疫、胚胎發(fā)育、再生醫(yī)學(xué)等。在MSCs研究領(lǐng)域，單細(xì)胞RNA測序技術(shù)的應(yīng)用可以解決異質(zhì)性問題，將細(xì)胞群體進(jìn)一步細(xì)分，分析不同來源、不同亞群MSCs的特點，尋找新的細(xì)胞標(biāo)志物，針對不同患者、不同治療需求選擇不同細(xì)胞，助力再生醫(yī)學(xué)、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展；研究MSCs的組織分布、參與的生物學(xué)過程和機(jī)制可能促進(jìn)對干細(xì)胞生理功能與不同條件下作用的理解，并找出可能有效的干預(yù)靶點，為疾病的治療方法提出新的假設(shè)；MSCs作為再生醫(yī)學(xué)中極具潛力的種子細(xì)胞，通過單細(xì)胞RNA測序觀察其誘導(dǎo)分化過程可以為新的治療手段打下理論基礎(chǔ)。

展望未來，單細(xì)胞RNA測序技術(shù)必然在精度和成本上有進(jìn)一步的提升，其普及將為自然科學(xué)研究帶來新的飛躍。