囊泡單胺轉運蛋白2 的研究進展

丁施燕 ，顧曉松

（1 南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學院整合醫(yī)學學院，江蘇210023；2 南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室）

囊泡單胺轉運蛋白 2 （vesicular monoamine transporter 2，VMAT2）作為囊泡單胺轉運蛋白家族成員之一，參與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉運，其功能喪失會引發(fā)神經(jīng)、消化、內(nèi)分泌等系統(tǒng)多種疾病。隨著分子生物學、電生理學、影像學等多學科領域的發(fā)展，對VMAT2 分子結構、生物學特征、作用機制等研究不斷深入，為VMAT2 相關疾病的生理病理學研究和治療提供了更多的依據(jù)和思路。

1 囊泡單胺轉運蛋白家族

囊泡單胺轉運蛋白（VMATs）是神經(jīng)元和內(nèi)分泌細胞分泌囊泡脂質(zhì)雙層膜的重要蛋白。其功能是傳遞乙酰膽堿及生物胺到分泌囊泡中，再通過胞吐作用轉移至細胞外。VMATs 家族分為VMAT1、VMAT2和囊泡乙酰膽堿轉運體（vesicular acetylcholine transporter，VAChT）[1]，這三種蛋白具有相似的同源序列，但發(fā)揮不同的作用。VMAT1 主要存在于各種神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，在腸嗜鉻細胞的致密核心囊泡中也有表達[2]。VAChT 與產(chǎn)生乙酰膽堿的生物合成酶、膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）在神經(jīng)元中共同表達。VAChT 是一種獨特的標記物，可以對膽堿能突觸和神經(jīng)效應器連接進行標記[3]。VMAT2 主要在含有多種單胺能細胞的腦、交感神經(jīng)系統(tǒng)、肥大細胞中表達，也在含有組胺的腸中表達[4]。

2 VMAT2 的結構

VMAT2 是一種酸性蛋白，表觀分子質(zhì)量為70kDa[5]。VMAT2 晶體結構尚未明確，但蛋白質(zhì)氨基酸疏水圖顯示VMAT2 由515 個氨基酸構成，具有12 個跨膜結構域的跨膜蛋白[6]。VMAT2 結構與功能關系主要通過誘變和光親和標記確定。

3 VMAT2 的分布

3.1 VMAT2 在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的表達 VMAT2 在靈長類動物腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細胞中均有表達，然而在嚙齒類動物中只在“神經(jīng)旁節(jié)”型細胞中表達。在胰島、小葉內(nèi)和小葉間導管以及外分泌軟細胞組織中的靜脈曲張神經(jīng)纖維中也可檢測到WMAT2[7]。

兼有去甲腎上腺素能和膽堿能的神經(jīng)元是否存在VMAT2，明顯影響其傳遞神經(jīng)遞質(zhì)的功能，這一影響具有物種特異性，且在發(fā)育過程中發(fā)揮至關重要的作用[8]。目前研究較多的是來源于牛腎上腺嗜鉻顆粒的VMAT2[9-10]?？茖W家證實單胺類物質(zhì)的轉移受濃度梯度和電化學梯度的共同作用，胞漿胺向內(nèi)轉運伴隨兩個質(zhì)子的流出耦合[11-12]。第一質(zhì)子從顆?；|(zhì)流出，產(chǎn)生在胞質(zhì)相中具有高親和力胺結合位點的轉運蛋白構象。第二質(zhì)子的流出與第二大構象變化相結合，導致胺從胞質(zhì)相向基質(zhì)相的移動，同時伴隨胺結合親和力的降低[13]。

3.2 VMAT2 在嚙齒動物和靈長類動物腦中的表達 VMAT2 在嚙齒動物和人腦的單胺多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、組胺（His）和 5-羥色胺（5-HT）神經(jīng)元以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細胞中均有表達。依據(jù)現(xiàn)有實驗研究，在絕大多數(shù)成年嚙齒動物和靈長類動物中，VMAT2 陽性細胞分布無明顯的物種差異，然而在發(fā)育不同階段VMAT2 陽性細胞具有差異性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒動物自胚胎形成后VMAT2會在丘腦皮質(zhì)的神經(jīng)纖維中瞬時表達，胚胎16 天至出生6 天VMAT2 可以從細胞外清除5-HT[15]，但未發(fā)現(xiàn)靈長類動物VMAT2 在丘腦皮質(zhì)具有瞬時表達作用[16]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，VMAT2 在嚙齒動物中腦黑質(zhì)區(qū)和腹側背蓋區(qū)域表達，免疫金標記法顯示與黑質(zhì)致密部（substantianigrapars compacta，SNpc）相比，腹側背蓋區(qū)（ventral dorsal tegmental，VTA）樹突中VMAT2 的表達量更高[17]。放射性研究發(fā)現(xiàn)，VMAT2在紋狀體中的表達量最高。此外，免疫組織化學及蛋白質(zhì)印記技術研究發(fā)現(xiàn)，VMAT2 在紋狀體沿腹側至背外側表達量最高[18]。

3.3 VMAT2 在消化系統(tǒng)中的表達 消化系統(tǒng)中含單胺細胞主要包括腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、腸的腸嗜鉻細胞和胃的腸嗜鉻細胞細胞。胃的腸嗜鉻細胞表達VMAT2，并從食物中合成和儲存組胺。胃的腸嗜鉻細胞中His 和5-HT 高表達，從而使得腸的腸嗜鉻細胞中出現(xiàn)單胺[19]。人類胰腺β 細胞也表達VMAT2，但胰島素瘤或胰腺內(nèi)分泌腫瘤通常使VMAT2 無法表達[20]。VMAT2 在肥大細胞和腸道中的肥大細胞瘤中也具有較高的表達量[21-22]。在整個腸神經(jīng)系統(tǒng)中均存在VMAT2 神經(jīng)元，研究者認為VMAT2 神經(jīng)元可代表經(jīng)典的“5-羥色胺能腸神經(jīng)系統(tǒng)”假說[23]。然而事實上，VMAT2 與TH 和色氨酸羥化酶的協(xié)同作用揭示除了5-羥色胺能神經(jīng)元亞群外，人類腸道還有大量的多巴胺能神經(jīng)元。

4 VMAT2 的作用機制

4.1 翻譯后修飾 VMAT2 翻譯后修飾主要包括磷酸化和糖基化。VMAT2 的N 端和C 端胞質(zhì)區(qū)均被磷酸化，雖然磷酸化的作用尚不清楚，但是初步研究發(fā)現(xiàn)VMAT2 的N 端磷酸化對維持VMAT2 單胺類攝取是必要的，可能對于刺激性誘導的突觸小泡單胺類流出也至關重要[24]。對VMAT2 的N 端結構研究初步確定N 端磷酸化的蛋白激酶為PKA 和PKC，而C 端磷酸化激酶主要為磷酸化激酶Ⅰ和Ⅱ，這兩種激酶有助于VMAT2 留在致密核囊泡中[25-26]，可見C末端磷酸化在VMAT2 定位到單胺能突觸小泡中起重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，除了N 端和C 端存在磷酸化外，第六和第七個跨膜結構域之間的胞質(zhì)連接區(qū)域也存在一些具有激酶結合基序的氨基酸，但目前無證據(jù)表明這些氨基酸也參與VMAT2 的調(diào)控。

VMAT2 囊泡靶向主要由于第一、第二跨膜結構域之間連接區(qū)和C 末端的N-連接糖基化。VMAT2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，在高爾基體中糖基化。如果只有兩個跨膜區(qū)域糖基化是不能將VMAT2 轉運到致密核心的囊泡中的，若沒有C 端和連接域糖基化，VMAT2 只能被轉運至小囊泡中。多巴胺終端的VMAT2 主要儲存在小的突觸小泡中，意味著只有一小部分VMAT2 在高爾基體中糖基化，從而在多巴胺能細胞中會被分選成大而致密的核心小泡，另外一部分非糖基化VMAT2 會被分選成組成性分泌囊泡。這些分泌囊泡隨后被運輸?shù)捷S突并整合到質(zhì)膜上，進一步形成VMAT2 突觸小泡。

4.2 VMAT2 與蛋白質(zhì)的相互作用 關于VMAT2與蛋白質(zhì)相互作用機制的研究較少。依據(jù)現(xiàn)有的研究，VMAT2 與 TH、芳香氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）形成復合物，其中TH 和AADC 分別是多巴胺合成的限速酶和終止酶，可以直接和多巴胺腦區(qū)分離的突觸小泡上的VMAT2 相互作用[27]。VMAT2-TH-AADC 復合物表明多巴胺在突觸前終端內(nèi)受到空間限制，如果該復合物丟失，則會導致突觸前終端功能障礙。

此外，VMAT2 也可與熱激伴侶蛋白 70（heat shock chaperone70，Hsc70）相互作用。Hsc70 是一種熱休克蛋白，它主要的作用是去除囊泡中的網(wǎng)格蛋白層，進而進入內(nèi)吞途徑[28]。研究發(fā)現(xiàn)，Hsc70 與VMAT2 在突觸小泡中結合會降低單胺攝取量，這意味在內(nèi)化和突觸小泡重組的特定階段，VMAT2 的功能可能受到抑制。因此，如果VMAT2 所在的突觸小泡在不恰當?shù)臅r機釋放，會損害轉運體的功能。

4.3 突觸前定位 VMAT2 轉運功能與其在突觸小泡中的位置有關。例如，精神刺激劑在膜結合和細胞質(zhì)粗大的突觸囊泡組分之間差異性地重新分配VMAT2，會改變VMAT2 的攝取和囊泡多巴胺的含量。雖然還不清楚VMAT2 重新分布是引起VMAT2減少的原因還是結果，但是突觸前的定位在調(diào)節(jié)VMAT2 螯合單胺的能力中起著關鍵作用。

5 VMAT2 的功能

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中VMAT2 可以將神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)轉移至突觸前末端的囊泡中。VMAT2 充當信使，將某些神經(jīng)遞質(zhì)、激素、旁分泌或自分泌因子從細胞質(zhì)轉運至突觸小泡中，最終釋放至胞外。VMAT2不僅參與遞質(zhì)的傳遞、釋放等，還負責多巴胺儲存。多巴胺在神經(jīng)元中合成后，被VMAT2 隔離至囊泡[29]。未被包裝的多巴胺被單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）降解為 3，4-二羥基苯乙醛（3，4-dihydroxyphenylacetaldehyde，DOPAL），并被醛脫氫酶進一步氧化為3，4-二羥基苯乙酸（3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）[30-31]。負責運輸多巴胺的囊泡通過運動蛋白轉移到質(zhì)膜，并與一系列蛋白質(zhì)復合物相互作用，進一步引發(fā)囊泡膜融合[32]。

6 VMAT2 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

6.1 遲發(fā)型運動障礙 遲發(fā)型運動障礙（tardive dyskinesia，TD）是一種由于多巴胺受體阻滯而引起的運動障礙性疾病[33]，癥狀表現(xiàn)為面部和舌頭的不自主運動，如咀嚼、舔唇以及四肢的舞蹈狀運動等。TD 病理生理機制尚未清楚，但大多數(shù)研究表明是由于多巴胺受體長時間受阻造成。對遺傳標記進行檢測后發(fā)現(xiàn)，VMAT2 抑制劑可以緩解TD。由于管腔囊泡的 pH 較低，VMAT2 可以將 DA、NE 以及 5-HT 轉運至突觸小泡中，VMAT2 抑制劑參與單胺氧化酶中斷單胺的運輸和降解，從而降低單胺含量。突觸后多巴胺受體的超敏性會引起TD，因此VMAT2 對研究TD 病理生理具有重要意義[34]。臨床上可使用VMAT2抑制劑纈苯那嗪和二苯嗪靶向治療TD 患者。

6.2 亨廷頓病 亨廷頓病（Huntington disease，HD）是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，影響運動及精神功能，嚴重者最終會死亡，目前尚無有效方法治療HD。研究發(fā)現(xiàn)采用VMAT2 抑制劑可以減少多巴胺釋放，從而緩解HD。2008 年美國FDA 批準四苯那嗪用于治療HD。此外，氘化四苯那嗪、氘苯丁嗪也可以改善TD。

6.3 帕金森病 帕金森病（Parkinsondisease，PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要集中在老年人。隨著多巴胺能神經(jīng)元顯著缺失和路易小體形成，患者表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢步態(tài)異常等經(jīng)典運動癥狀，也會出現(xiàn)非運動癥狀，如睡眠障礙、焦慮、抑郁和便秘等，患者生活質(zhì)量嚴重下降[35]。PD 病理特征是黑質(zhì)區(qū)域多巴胺損害以及紋狀體區(qū)域多巴胺的耗竭[36]。研究發(fā)現(xiàn)，VMAT2 是神經(jīng)末端多巴胺的重要調(diào)節(jié)因子，它可以利用電化學梯度將多巴胺包裝成突觸核泡，從而提高多巴胺的含量[37]。

7 VMAT2 與糖尿病

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者主要臨床表現(xiàn)為高血糖，分為1 型糖尿?。═1DM）和2 型糖尿?。═2DM），兩者共同點是β 細胞的質(zhì)量下降，對β 細胞質(zhì)量檢測成為監(jiān)測糖尿病的一個重要方面，通過正電子發(fā)射斷層掃描可以測量β 細胞的質(zhì)量。在糖尿病動物模型中，研究者發(fā)現(xiàn)可以使用VMAT2 作為胰島素的組織特異性替代標志物，還可利用11C二氫丁苯那嗪作為特異性放射配體。VMAT2 作為標記物既可以對β 細胞進行無創(chuàng)成像，又可以直接將β 細胞可視化。此外，體外研究也表明VMAT2 也可以進行胰腺成像。原位雜交、免疫組織化學和共聚焦顯微鏡等技術顯示，VMAT2 和胰島素共定位在人胰島β 細胞中。

8 展 望

既往關于VMAT2 的研究多局限于微觀，大多集中于細胞之間或單系統(tǒng)，如VMAT2 在腦、消化系統(tǒng)特定細胞中作用機制的探討。如今關于腦-腸軸理論，代謝組學、轉錄組測序技術、生物信息學技術的發(fā)展為更廣泛深入研究VMAT2 提供了新的工具和方法。隨著對VMAT2 進一步研究，將為解答諸多生物學問題，開發(fā)新的治療神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的藥物帶來曙光。