腸桿菌科細(xì)菌替加環(huán)素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

朱瑞奇，吳韓，曾楊梅，吳俊偉

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶榮昌402460；2.重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司）

腸桿菌科細(xì)菌屬于革蘭陰性菌，常寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)，可在土壤、水和腐爛物中檢測出，能引起多種感染，如肺炎、肝膿腫、尿路感染、菌血癥、敗血癥等，是引起感染的重要病原體之一。近年來，由于抗生素的普遍使用，引發(fā)了嚴(yán)重的耐藥危機(jī)，尤其是產(chǎn)碳青霉烯酶菌的出現(xiàn)，該類型的腸桿菌幾乎對(duì)所有的抗生素耐藥，嚴(yán)重威脅了人類的健康[1]。

替加環(huán)素是1999年P(guān)haik-Eng Sum[2]首次報(bào)道具有強(qiáng)大抗菌活性一種新型合成甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物，全稱為9- 叔丁基甘氨酰氨基米諾環(huán)素，是繼多西環(huán)素、米諾環(huán)素、美他環(huán)素后開發(fā)的新一代四環(huán)素類衍生抗生素，主要用于復(fù)雜的皮膚結(jié)構(gòu)感染，腹腔內(nèi)感染及細(xì)菌性肺炎患者的治療。自美國批準(zhǔn)上市用于臨床后，替加環(huán)素因抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、耐藥率低等優(yōu)點(diǎn)而逐漸成為醫(yī)學(xué)臨床抗菌藥物中治療各類細(xì)菌感染效果最好的，也是最后一道防線藥物[3]。然而，隨著臨床抗感染治療中替加環(huán)素的不斷使用，有研究者已經(jīng)分離出替加環(huán)素臨床耐藥菌[4]。細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括外排泵機(jī)制、細(xì)胞膜孔通道蛋白變異、藥物結(jié)合位點(diǎn)改變及藥物酶降解。目前國內(nèi)外對(duì)替加環(huán)素耐藥性機(jī)制研究主要集中在細(xì)菌的主動(dòng)外排泵機(jī)制以及新發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)替加環(huán)素降解酶Tet(X)上?，F(xiàn)就腸桿菌科對(duì)替加環(huán)素耐藥機(jī)制進(jìn)行綜述，以減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和延長替加環(huán)素使用年限提供理論依據(jù)。

1 外排泵

1.1 AcrAB-TolC 外排泵

AcrAB-TolC 外排泵是腸桿菌科細(xì)菌中RND 家族是目前研究比較透徹的一類外排泵，這類外排泵既能外排對(duì)菌體有害的物質(zhì)，還能在某些條件下將致病菌的毒性因子排出。此類外排泵以不對(duì)稱三聚體的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，包括外膜通道蛋白TolC，內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體AcrAB、周質(zhì)蛋白AcrA 三部分。其中外膜和周質(zhì)蛋白主要是結(jié)合位點(diǎn)，而跨膜結(jié)構(gòu)作為質(zhì)子的通道，保證能量來源[5]。由正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子共同調(diào)節(jié)[6]，正調(diào)控因子主要包括MarA 蛋白、Rob 蛋白，SoxS 蛋白可向上調(diào)節(jié)AcrAB 基因表達(dá)水平從而導(dǎo)致耐藥，負(fù)調(diào)控蛋白主要包括AcrR 蛋白，MarR蛋白主要通過拮抗RamA 蛋白和MarA 蛋白從而抑制AcrAB 基因表達(dá)[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素耐藥與AcrAB-TolC 外排泵有關(guān)，Keeey,D.等[8]對(duì)臨床三期分離的對(duì)替加環(huán)素耐藥的大腸桿菌通過插入序列基因檢測等技術(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)MarR 基因突變使marA表達(dá)不受調(diào)控，引起AcrAB 過表達(dá)，以此增加臨床菌株對(duì)替加環(huán)素的耐藥性。Xu H 等[9]在血液樣本中分離出對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株，通過基因測序發(fā)現(xiàn)ramR 基因突變，導(dǎo)致AcrAB-TolC 過表達(dá)，從而表現(xiàn)出對(duì)替加環(huán)素耐藥。Mariu 等[10]通過讓大腸桿菌生長在酸性含有膽汁鹽的條件中，發(fā)現(xiàn)存活下來的細(xì)菌有一部分lon 基因發(fā)生突變，其中l(wèi)on 蛋白酶參與了大腸桿菌中marA 的降解，當(dāng)其功能損失時(shí)導(dǎo)致Mar 濃度增加，這會(huì)使AcrAB 外排泵過表達(dá)，增加菌株對(duì)替加環(huán)素耐藥，使大腸桿菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的替加環(huán)素抗性。

He F 等[11]對(duì)收集的肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)分析，最終確定的耐替加環(huán)素肺炎克雷伯菌株，通過基因測序等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)外排泵AcrAB-TolC表達(dá)量及其調(diào)控基因與MIC 成正比，且當(dāng)使用外排泵抑制劑的時(shí)候，MIC 的表達(dá)量明顯減少。Rajendran R 等[12]采用棋盤法對(duì)臨床分離的肺炎克雷伯菌進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)加入外排泵抑制劑時(shí)菌株能明顯恢復(fù)對(duì)替加環(huán)素的敏感性。何方[13]通過基因敲除、體外誘導(dǎo)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌25922-TGC8 中對(duì)替加環(huán)素耐藥是mla 系統(tǒng)外排泵AcrAB-TolC 和核糖體蛋白變異3 種機(jī)制共同作用的結(jié)果，最終使菌株對(duì)替加環(huán)素的MIC 從0.125mg/L 上升到8mg/L。因?yàn)閙la 系統(tǒng)，外排泵AcrAB 和核糖體蛋白均由細(xì)菌染色體編碼，當(dāng)細(xì)菌在替加環(huán)素藥物選擇作用下，外排泵基因易發(fā)生突變，進(jìn)而導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥的發(fā)生。且通過敲除acrAB 基因發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌基因缺失株明顯增加對(duì)替加環(huán)素的敏感性。后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)除了大腸桿菌、肺炎克雷伯菌外，其余腸桿菌屬細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素均具有耐藥性[14]。

1.2 KpgABC 外排泵

KpgABC 外排泵是RND 家族新發(fā)現(xiàn)的一種外排泵。Nielse L E 等[15]在耐替加環(huán)素的肺炎克雷伯菌的外排泵操縱子上游發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)IS5 插入序列并命名為KpgABC 在耐藥菌株中過量表達(dá)。細(xì)菌一般在惡劣的環(huán)境下容易發(fā)生突變，突變的類型一般包括堿基的置換、插入和缺失以及轉(zhuǎn)位因子的變異。而插入序列突變一般發(fā)生在細(xì)菌操縱子的上游與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力和生物膜形成的能力有關(guān)，同時(shí)細(xì)菌的生長速率會(huì)降低。其中IS5 作為家族成員最多的插入序列對(duì)耐藥基因的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]。Juan C 等[17]在肺炎克雷伯菌菌血癥患者中發(fā)現(xiàn)，有一例菌血癥患者由于KpgA 基因過度表達(dá)導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥。且通過克隆轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明，即使沒有其他外排泵的調(diào)節(jié)，單獨(dú)的KpgABC 外排系統(tǒng)即可導(dǎo)致肺炎克雷伯菌外排替加環(huán)素,雖未達(dá)到EUCAST 判斷標(biāo)準(zhǔn)，但明顯該菌株對(duì)替加環(huán)素MIC 增加，與AcrAB-TolC 外排泵相比可能KpgABC 外排由于親和力較弱，或者由于替加環(huán)素外排速度較低，導(dǎo)致細(xì)菌胞體內(nèi)藥物增加。

1.3 OqxAB 外排泵

OqxAB 外排泵屬于RND 家族，在2004年豬源大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)的一種新型質(zhì)粒編碼的外排泵，對(duì)于不同抗生素的抗性該基因位于不同類型的質(zhì)粒上，可介導(dǎo)呋喃妥因，氯霉素，氟喹諾酮類包括替加環(huán)素等多種藥物耐藥的外排系統(tǒng)[18]。與AcrAB-TolC外排泵結(jié)構(gòu)不同其主要由兩大結(jié)構(gòu)構(gòu)成即膜融合蛋白OqxA 和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OqxB 組成，質(zhì)粒傳播的OqxAB 一般來源于肺炎克雷伯菌的染色體[19]。Liu B等[20]證明由質(zhì)粒編碼的OqxAB 基因較容易在動(dòng)物，動(dòng)物源性食品和人類之間水平傳播。

Chen 等[21]發(fā)現(xiàn)攜帶OqxAB 質(zhì)粒的菌株對(duì)替加環(huán)素耐藥，并通過細(xì)菌攝入學(xué)實(shí)驗(yàn)測定該菌體內(nèi)替加環(huán)素的積累量，直觀表明OqxAB 外排泵的對(duì)替加環(huán)素耐藥的活性，且當(dāng)使用外排泵抑制劑及質(zhì)粒轉(zhuǎn)移能明顯恢復(fù)菌株對(duì)替加環(huán)素的敏感性。Wang J[22]發(fā)現(xiàn)oqxR 和RamR 基因突變都可以激活OqxAB 外排泵，造成細(xì)菌耐藥，但RamR 突變時(shí)既可以激活oqxAB 也可以激活A(yù)crAB-TolC 外排泵。Juan,C 等[17]通過對(duì)患肺炎克雷伯菌菌血癥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在治療前接觸過喹諾酮類藥物會(huì)增加細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的可能性，對(duì)替加環(huán)素耐藥的患者中，通過基因的表達(dá)量分析得知大部分AcrAB 或OqxAB 外排泵過度表達(dá)所致，其中一例患者是由KpgABC 過度表達(dá)所致，當(dāng)喹諾酮類藥物使用時(shí)，會(huì)增加RamA 基因突變的可能性，從而上調(diào)OqxAB 外排泵基因，最終導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥。Veleba 等[14]在對(duì)替加環(huán)素耐藥的陰溝桿菌中發(fā)現(xiàn)，ramA 和rarA基因的表達(dá)量增加，導(dǎo)致OqxAB 和AcrAB 外排泵過表達(dá)，使菌株降低對(duì)替加環(huán)素的敏感性。隨后Hang Liu 等[23]在也替加環(huán)素耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)AcrAB和OqxAB 過表達(dá)，替加環(huán)素耐藥可能與這兩種基因都有關(guān)，是否是協(xié)同作用，需更進(jìn)一步研究。

1.4 AcrEF 外排泵

在大腸桿菌的細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)的一種新的外排泵-AcrEF 外排泵[23]，在大腸桿菌中RND 家族的外排泵都需要共同的外膜通道TolC，發(fā)揮其外排泵的功能。研究發(fā)現(xiàn)，AcrE 與AcrF 可以和TolC 結(jié)合形成類似于AcrAB-TolC 的三聚體外排泵。Zhang 等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AcrAB-TolC 外排泵失活后，AcrEF 外排泵的過表達(dá)可補(bǔ)充其功能，繼續(xù)維持細(xì)菌的耐藥性，但該泵在正常情況下并不發(fā)揮作用，該基因單獨(dú)缺失對(duì)細(xì)菌的耐藥性沒有影響，提示在細(xì)菌中體內(nèi)可能作為替代泵存在。研究還發(fā)現(xiàn)它與AcrAB-TolC 外排泵有高度的同源性并能外排相同的的物質(zhì)，其中也包括了替加環(huán)素[26]。

1.5 Tet 突變體

Tet 屬于MFS 家族外排泵，主要與細(xì)菌對(duì)四環(huán)素耐藥性有關(guān)，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，Tet 外排泵突變可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥。正常情況下Tet 外排泵主要位于在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的磷脂雙層結(jié)構(gòu)上，但由于外排泵的跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)生基因突變，導(dǎo)致替加環(huán)素MIC 值顯著增高。Marius 等[27]通過對(duì)Tet 外排泵突變的菌株進(jìn)行了替加環(huán)素最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)及基因測序后發(fā)現(xiàn)，Tet(A)和Tet(M)外排泵、核糖蛋白體Tet(K)及質(zhì)粒編碼的修飾酶Tet(X)四種基因突變均導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素的MIC 增加，相比較而言Tet(A)在四環(huán)素抗性基因中對(duì)替加環(huán)素的耐藥更占優(yōu)勢。Chiu 等[28]在替加環(huán)素耐藥菌中，通過PCR 和基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)菌株存在ramR，acrR，oqxR，Tet(A)，Tet(K)，Tet(M)及rpsJ 基因突變，其中大部分以Tet(A)突變?yōu)橹?，隨后將該基因?qū)氲絩amR基因突變株中發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同作用。

2 結(jié)合位點(diǎn)突變

替加環(huán)素作用機(jī)制是通過可逆地結(jié)合于細(xì)菌30S 核糖體16S rRNA，阻斷tRNA 進(jìn)入A 位點(diǎn)，終止氨基酸進(jìn)入肽鏈，抑制翻譯過程，阻止蛋白合成，最終細(xì)菌繁殖受到抑制。由rpsJ 基因編碼的S10 蛋白是30S 核糖體的組成部分，位于替加環(huán)素與結(jié)合位點(diǎn)的附近。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)rspJ 基因突變時(shí)會(huì)使替加環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)的S10 蛋白缺失，導(dǎo)致細(xì)菌與藥物的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，從而會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[29]。Fang L 等[30]對(duì)7 株替加環(huán)素耐藥的肺炎克雷伯菌進(jìn)行基因測序分析，發(fā)現(xiàn)一共有ramR，lon 及rpsJ 三種類型的突變，其中rpsJ 基因突變占耐藥菌的14.2%。隨后相繼報(bào)道指出糞腸球菌，金黃色葡萄球菌對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥均與rpsJ 基因突變有關(guān)[31]。Li 等[32]發(fā)現(xiàn)經(jīng)替加環(huán)素治療后患者更易出現(xiàn)rpsJ基因突變導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥。由于替加環(huán)素核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近的S10 核糖蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素耐藥，相比較于非特異性的依賴于細(xì)菌種類的主動(dòng)外排泵耐藥機(jī)制，rpsJ 基因缺失突變不依賴于細(xì)菌種類，具有高度特異性耐藥，是多種細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的靶點(diǎn)[33]。He 等[34]對(duì)肺炎支原體的患者連續(xù)進(jìn)行替加環(huán)素治療后，分離出耐藥的肺炎克雷伯菌，并對(duì)其進(jìn)行基因測序生物學(xué)技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)rpsJ 基因突變，表明rpsJ 突變?cè)谥委煹倪^程中可對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥性。

3 細(xì)菌細(xì)胞膜變異

細(xì)菌細(xì)胞膜由糖脂，磷脂和蛋白質(zhì)構(gòu)成。plsC是催化合成磷脂的重要酶之一，同時(shí)也是一種跨膜蛋白，參與細(xì)胞滲透性功能[35]。PlsC 基因突變可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變，降低細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性[36]。細(xì)菌膜上存在的膜孔蛋白是影響物質(zhì)和抗生素進(jìn)入細(xì)菌的主要途徑，當(dāng)細(xì)菌處于惡劣環(huán)境下時(shí)，膜孔蛋白基因發(fā)生突變，導(dǎo)致膜孔蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或者膜孔蛋白表達(dá)數(shù)量減少，改變細(xì)胞的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。但是在大多數(shù)情況下，耐藥菌株并不是單一的膜孔蛋白變異，一般與其他耐藥機(jī)制共同存在。

4 修飾酶的降解

Tet(x)是一種質(zhì)粒產(chǎn)生的四羥酮醇依賴的單氧化酶，在有氧和NADPH 條件下對(duì)四環(huán)素進(jìn)行化學(xué)修飾，可促使臨床應(yīng)用的四環(huán)素包括替加環(huán)素失活，最先是在擬桿菌轉(zhuǎn)座子Tn4351 和Tn4400 中分離純化的四環(huán)素降解酶。Volkers 等[37]通過X 光衍射射線晶體學(xué)技術(shù)，表明替加環(huán)素是tet(x)的底物。隨后，Bartha 等[38]在臨床菌株中發(fā)現(xiàn)tet(x)及其同源基因tet(x1)，tet(x)和tet(x1)的流行率與替加環(huán)素敏感性有關(guān)，這些基因與質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子關(guān)系密切。Walkiewicz,K 等[39]利用X 射線技術(shù)也同樣證明了tet(x2)作為四環(huán)素降解酶的作用。

He T 等[41]在動(dòng)物源性的腸桿菌科細(xì)菌中分離出對(duì)替加環(huán)素耐藥的抗性基因tet(x3)和tet(x4)。體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)表明替加環(huán)素被這兩種酶降解造成藥物失活。隨后Sun 等[41]在分離對(duì)替加環(huán)素耐藥的大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒上存在替加環(huán)素抗性基因tet(x4)，全長1158 bp，編碼385 個(gè)氨基酸蛋白，氨基酸含量為94.5%。該菌株能夠降解所有四環(huán)素，包括替加環(huán)素。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，臨床菌株中IncQ1 質(zhì)粒所攜帶的tet(x4)基因能夠迅速高效的轉(zhuǎn)移到各種臨床耐藥菌株和實(shí)驗(yàn)室保存菌株中。隨后在養(yǎng)殖場附近的環(huán)境中以及動(dòng)物的腸道中也發(fā)現(xiàn)了該基因，這也證實(shí)了質(zhì)粒所攜帶的基因替加環(huán)素耐藥基因tet(x4)可迅速傳播[42]。

5 結(jié)語

致病性微生物耐藥已經(jīng)引起全世界的關(guān)注，主動(dòng)外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，是引起的替加環(huán)素中低耐藥為腸桿菌科的主要的耐藥機(jī)制，后期應(yīng)著重研究抑制外排泵抑制劑方向。另外一項(xiàng)新研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物及養(yǎng)殖環(huán)境中發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致最后一道防線藥物替加環(huán)素失活的質(zhì)粒介導(dǎo)的降解酶tet(x4)，并具有高效轉(zhuǎn)移性。雖然替加環(huán)素并未批準(zhǔn)用于食品生產(chǎn)動(dòng)物，但是在臨床實(shí)踐中如果持續(xù)使用四環(huán)素類的藥物，tet(x4)基因也進(jìn)入致病性病原微生物。因此應(yīng)深入研究替加環(huán)素的耐藥機(jī)制，改進(jìn)用藥方案，避免濫用抗生素，減少長期用藥，盡可能采取交叉用藥，穿梭用藥或聯(lián)合用藥，延長替加環(huán)素使用年限。