江西首例禽戊型肝炎的診斷

李海琴，康昭風(fēng)

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌330200）

戊型肝炎(Hepatitis E,HE) 是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的以腸道傳播為主的傳染性疾病。該病也稱為大肝大脾?。˙ig liver and spleen disease, BLS） 或肝炎脾大綜合癥（hepatitis-splenomegaly,HS），1988年，雞BLS 在澳大利亞就已經(jīng)被描述報(bào)道，幾乎在同一時(shí)間，加拿大和美國(guó)也有類似該病臨床癥狀的HS 綜合癥疾病的報(bào)道，一直到1999年P(guān)ayne 等研究者才從患有BLS的病雞中分離獲得了BLS 病毒（BLS virus,BLSV），并通過一小段病毒的核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列與戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）的核酸序列有著較高的同源性。2001年，Haqshenas 等從患有HS 綜合癥的病雞中分離獲得了該病毒并命名為禽HEV，通過序列分析發(fā)現(xiàn)，BLSV 與禽HEV 可能是同一病毒的不同變異株[1]。

在我國(guó)，1994年單松華等利用瓊擴(kuò)試驗(yàn)證實(shí)了BLSV 抗體在我國(guó)雞群中的存在，2005年馬玉玲等利用RT-PCR 方法從南京某雞場(chǎng)擴(kuò)增獲得了一小段BLSV 的核酸序列，但是并沒有后續(xù)的相關(guān)報(bào)道[2]。近幾年在我國(guó)多個(gè)省份報(bào)道了本病的發(fā)生[3]。資料顯示，致病型禽戊型肝炎病毒主要危害成年母雞，綜合致死率不高；而非致病型禽戊型肝炎病毒毒株可在某些健康雞群中長(zhǎng)期存在[4]。但近年來，我國(guó)多個(gè)大型雞場(chǎng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的肝破裂出血綜合征，其發(fā)病時(shí)間以17 周齡為主，其臨床多表現(xiàn)為雞冠蒼白、精神沉郁、腹瀉、肛門周圍羽毛被污染或有糊狀糞便。HEV 感染導(dǎo)致成年雞死淘率大幅提高并嚴(yán)重影響產(chǎn)蛋，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

HEV 最早通過免疫電鏡觀察推斷為小RNA 病毒[5]，在2001年，由于該病毒形態(tài)與杯狀病毒類似，Kabrane 等將其歸為嵌杯病毒科[6]。病毒呈不規(guī)則的球狀，無外膜，屬于正鏈、單股RNA 病毒[7]；病毒顆粒有60 個(gè)亞單位，其亞單位結(jié)構(gòu)呈凹形或六鈴體。病毒內(nèi)部有致密和透亮兩種形態(tài)，分別為完整和不完整的病毒顆粒。病毒對(duì)溫度抵抗力較弱，在低溫時(shí)不穩(wěn)定，4℃下容易裂解，反復(fù)凍融易導(dǎo)致病毒喪失部分生物學(xué)活性，在液氮中可長(zhǎng)期保存，該病毒可被含碘化物的消毒劑殺死，對(duì)酸和堿有抵抗力。

最近江西某規(guī)模蛋雞場(chǎng)發(fā)生疑似禽戊型肝炎感染的病例，經(jīng)臨床診斷及實(shí)驗(yàn)室的診斷，確診為禽戊型肝炎感染。

1 臨床癥狀與剖檢病變

江西撫州市某規(guī)模化蛋雞場(chǎng)飼養(yǎng)的品種為羅曼褐蛋雞，2020年4月上旬17 周齡雞開始陸續(xù)出現(xiàn)雞冠蒼白、萎縮，肛門周圍羽毛被糞便污染，腳墊水腫等癥狀的雞只，至24 周齡時(shí)正常產(chǎn)蛋率應(yīng)該達(dá)到90%以上，但這些蛋雞的產(chǎn)蛋率只有70%左右，期間用了多種抗生素治療基本無效，瀕死雞消瘦，雞冠發(fā)育不良或萎縮，日死亡率在0.2%左右。剖檢病死雞，臨床病變主要表現(xiàn)為雞冠蒼白萎縮，肛門周圍有糞污，肝臟腫大、出血，有的肝破裂、被膜下有血凝塊，脾腫大，有的肝臟出現(xiàn)綠肝，卵巢發(fā)育不良，萎縮。其他器官剖檢未見明顯病變，見圖1。

圖1 病死雞臨床剖檢圖

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病理切片分析

無菌采集病死雞的心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、氣管、食道、十二指腸等組織樣品，置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片制作、HE 染色、切片成像和組織病理學(xué)檢查分析,結(jié)果見圖2。

注：A：肝組織廣泛可見淀粉樣變，大量肝竇及血管淤血。B：脾組織白髓結(jié)構(gòu)消失，紅髓淋巴細(xì)胞排列較疏松，局部可見小灶性壞死，胞核溶解，呈嗜酸性均質(zhì)狀。

2.2 套式RT-PCR 檢測(cè)

2.2.1 樣品采集與處理。無菌采集病、死雞的新鮮肝臟、脾臟分別置于1.5mL 離心管中，冰上充分剪碎，加入無菌PBS 溶液200μL，顛倒混勻，上述病料懸液用低溫離心機(jī)12000r/min，離心2min，離心結(jié)束后，取上清液150μL；另取膽汁樣品150μL 進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄。按照RNA 提取試劑盒說明書對(duì)上述150μL 的不同樣品進(jìn)行統(tǒng)一的處理并提取其RNA，獲得RNA 產(chǎn)物后利用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用通用引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.2.3 PCR 擴(kuò)增。以獲得的cDNA 產(chǎn)物為模板，利用設(shè)計(jì)的套式PCR 外用引物進(jìn)行1 輪PCR 擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照；以1 輪PCR 產(chǎn)物為模板，利用設(shè)計(jì)的套式PCR 內(nèi)用引物進(jìn)行2 輪PCR 擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

2.2.4 PCR 產(chǎn)物純化、測(cè)序。所有PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，將符合目的片段大小242bp(見圖3)的條帶切膠、通過凝膠帶純化試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，并將其克隆到PMD18T 載體中，然后進(jìn)行測(cè)序分析。

圖3 電泳圖

3 診斷

通過病史調(diào)查、臨床癥狀和剖檢變化，初步診斷為禽戊肝感染。組織樣品病理切片結(jié)果顯示肝臟淀粉樣變，肝臟和脾臟嚴(yán)重出血，而其他器官未發(fā)現(xiàn)明顯組織變化；套式RT-PCR 結(jié)果顯示出現(xiàn)242bp 的目的條帶，而陰性對(duì)照沒有相應(yīng)條帶；序列同源性分析結(jié)果顯示分離株與我國(guó)目前流行的幾個(gè)HEV 毒株最高同源性為98.3%。因此，上述病例可以確診為HEV 感染。這也是江西首次對(duì)禽戊型肝炎病例的確診。

4 防控

對(duì)于禽戊型肝炎病毒的防控要從多方面努力，而不要只關(guān)注用什么藥，有什么疫苗。目前世界范圍內(nèi)還沒有商品化禽戊型肝炎病毒疫苗。除了疫苗，很多措施目前在生產(chǎn)中被發(fā)現(xiàn)是有效的，比如，有專家發(fā)現(xiàn)中藥和微生態(tài)制劑對(duì)于降低禽戊型肝炎病毒感染的危害是有作用的，抗病毒藥的使用或干擾素的使用可以降低發(fā)病率和死亡率，并縮短病程。另外，有研究發(fā)現(xiàn)HEV 感染會(huì)造成循環(huán)系統(tǒng)受阻，病雞出現(xiàn)腳墊水腫、膽汁回流等癥狀，因此減少應(yīng)激應(yīng)該作為防控禽戊肝防控的第一要素。在這些基礎(chǔ)上，有條件的雞場(chǎng)應(yīng)始終把加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)疫病凈化清除病原作為一個(gè)很重要的前提。

雞場(chǎng)執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施能夠限制病毒的傳播。堅(jiān)持對(duì)環(huán)境的消毒工作，特別是帶雞消毒，使用碘制劑和戊二醛制劑交替使用較好；及早發(fā)現(xiàn)，如果發(fā)現(xiàn)有戊型肝炎發(fā)病，除加強(qiáng)消毒外，還要及早淘汰患雞，盡量減少傳播機(jī)會(huì)。因?yàn)槲煨透窝卓梢源怪眰鞑?，所以，進(jìn)苗時(shí)應(yīng)調(diào)查種雞場(chǎng)是否發(fā)生過戊型肝炎，嚴(yán)格選擇雞苗來源場(chǎng)，防止垂直傳播。此外，雞場(chǎng)應(yīng)控制好免疫抑制性疾病，有報(bào)道HEV 與雞馬立克氏病毒混合感染會(huì)加劇肝腫大和破裂，當(dāng)受到免疫等應(yīng)激時(shí)更容易出現(xiàn)集中死亡。禽戊肝病毒感染帶毒和發(fā)病受到很多其它誘發(fā)因素的影響，因此應(yīng)該把這些問題系統(tǒng)解決，多方位防控HEV 的發(fā)生和感染。