miR-144在心血管系統(tǒng)疾病中的研究進展

馬明仁，王菲，胡威，蔡曉慶，張鵬，原斌，馬凌

解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院心血管內(nèi)科，蘭州 730050

MicroRNA(miRNA)是動、植物中普遍存在的控制重要生物學(xué)進程的調(diào)節(jié)因子，也是研究最為廣泛的一類非編碼調(diào)節(jié)RNA[1-3]，包括外顯子miRNA及內(nèi)含子miRNA，長度18～25個核苷酸。miRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成前體miRNA(pri-miRNA)，然后經(jīng)Drosha/pasha切割形成70個核苷酸左右的primiRNA，通過exportin-5等分子作用轉(zhuǎn)運出核，在細(xì)胞質(zhì)中由Dicer等加工為成熟miRNA，最后成熟miRNA分子與Argonaute蛋白等形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，并作用于特異靶mRNA的3'UTR，從而抑制翻譯過程，通過去腺苷酸化和脫帽引起靶mRNA降解[4-5]。隨著核酸高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的逐步發(fā)展，利用基因芯片結(jié)合mRNA質(zhì)/核比篩選及生物預(yù)測軟件，眾多與疾病相關(guān)的miRNAs及其靶基因相繼被發(fā)掘。在心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)中，許多研究已經(jīng)將miRNA作為病理生理過程及疾病預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[6]。miR-144作為一種在進化上高度保守的miRNA，在人類定位于17號染色體上，以miR-144/miR-451基因簇形式存在，兩個基因相隔93bp[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-144在心肌細(xì)胞中高表達，其高表達可促進心肌氧化應(yīng)激，從而誘發(fā)心肌損傷相關(guān)疾病的發(fā)生，并且已經(jīng)證實其靶基因腫瘤抑制因子(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)涉及心肌細(xì)胞死亡信號通路，國內(nèi)外多個臨床試驗也證實miR-144在心血管系統(tǒng)生理和正常發(fā)育以及CVD發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[8]。本文就miR-144在CVD發(fā)生發(fā)展中的最新研究進展進行綜述。

1 miR-144與冠心病

冠心病(coronary heart disease，CHD)是最常見的CVD，主要因為長期慢性炎癥損傷動脈管壁，造成膽固醇沉積及血管重構(gòu)而引起冠脈狹窄，主要病理過程為脂質(zhì)代謝平衡的破壞及炎癥反應(yīng)的激活。前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)及CHD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]， 且AS是導(dǎo)致CHD的主要原因。Cao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者血清中miR-144的表達量明顯增高，可能在AS及CHD的病理過程中發(fā)揮重要作用，且miR-144水平與CHD嚴(yán)重程度相關(guān)，提示其可作為CHD的潛在生物標(biāo)記物。脂代謝異常為CHD最主要的獨立危險因素之一，已經(jīng)證實miR-144可通過靶向ATP結(jié)合蛋白1(ATP binding cassette protein 1，ABCA1)來調(diào)節(jié)膽固醇代謝[11]，而miR-144的模擬物(mimics)可通過抑制ABCA1的表達降低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，加速AS進程。miR-144-3p mimics可在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)不同類型膽固醇明顯上調(diào)，在復(fù)雜的體內(nèi)平衡網(wǎng)絡(luò)中對膽固醇代謝起關(guān)鍵作用，器官或組織中ABCA1的表達及活性降低會對脂蛋白亞類不同的AS保護功能產(chǎn)生負(fù)面影響[12-13]。也有研究證實，miR-144通過抑制ABCA1表達降低血清中HDL-C的水平，并能促進炎性因子的表達[14]。 miR-144的調(diào)節(jié)或許可為血脂異常及AS等血管疾病提供潛在的治療手段。miR-144在脂質(zhì)代謝及炎癥因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，CHD患者的血漿miR-144水平明顯升高，且與CHD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，檢測血漿miR-144水平可能有助于預(yù)測CHD及其嚴(yán)重程度[15]。

早期研究發(fā)現(xiàn)心臟中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-4對miR-144/miR-451啟動子有激活作用，miR-144/miR-451過表達增加了心肌細(xì)胞存活率，敲除則顯示了相反的作用[16]。miR-144/miR-451靶向CUG三聯(lián)體重復(fù)結(jié)合蛋白2(CUG triplet repeat,RNA binding protein 2，CUGBP2)，后者是一種廣泛表達的RNA結(jié)合蛋白，可與環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) 的3'端相結(jié)合，在miR-144/miR-451過表達心肌細(xì)胞中，CUGBP2蛋白水平大大降低且COX-2活性明顯增加，miR-144/miR-451基因簇至少部分靶向調(diào)節(jié)CUGBP2-COX-2途徑，對模擬心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion injury，I/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護作用[16]。Lusha等[17]證實，在大鼠I/R 模型中miR-144表達下調(diào)，miR-144通過靶向調(diào)節(jié)FOXO1減輕I/R損傷，過表達miR-144能夠明顯減輕心肌缺血損傷及細(xì)胞凋亡，在H9C2細(xì)胞實驗中也驗證了相似現(xiàn)象。在低氧條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體所含miR-144通過靶向調(diào)節(jié)PTEN/Akt途徑來抑制心肌細(xì)胞凋亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除miR-144能明顯抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑，增加心肌梗死區(qū)域面積，阻礙心臟重塑及功能恢復(fù)[19]。細(xì)胞遷移實驗及體外成腔實驗結(jié)果表明，miR-144可抑制細(xì)胞遷移及成管[20]。

越來越多的研究證據(jù)表明，miR-144與脂質(zhì)代謝、炎性反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)，而脂類代謝異常又是CHD發(fā)生的重要因素。因此，miR-144與CHD之間的相關(guān)性可能為CHD診療提供更多可行方案。

2 miR-144與心律失常

心律失常的發(fā)生往往伴隨多種離子通道及傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)的改變，而miRNA在其中扮演的角色也逐漸被揭示。心房顫動(atrial fibrillation，AF)心臟電生理紊亂而導(dǎo)致的心臟異常搏動，是臨床發(fā)病率最高的心律失常之一，其發(fā)病率隨年齡增長而增高，可誘發(fā)心力衰竭、卒中及外周血管栓塞等致死性CVD。其發(fā)病機制有心房的電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心肌代謝、神經(jīng)體液及分子表達異常，心臟離子通道功能失調(diào)等[21-22]，病理基礎(chǔ)主要是心房纖維化及心房擴張[23]。研究表明，miRNA與AF的發(fā)生及維持密切相關(guān)，循環(huán)miR-144在致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)伴室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)患者中表達豐度升高，提示miR-144可能對ARVC診斷有用，但ARVC中循環(huán)miRNA與組織miRNA之間的相關(guān)性仍有待進一步研究[24]。miR-144-3p在人肺成纖維化細(xì)胞中可促進纖維化相關(guān)基因如Ⅰ型膠原α1鏈基因(COL1A2)、膠原蛋白3α1(COL3A1)、平滑肌肌動蛋白α2(ACTA2)及纖維連接蛋白(fibronectin)的表達，在纖維化調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用[25]。Smad蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)受體信號傳導(dǎo)的中介物質(zhì)，是調(diào)控纖維化的重要信號通路。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p通過激活Smad3信號通路發(fā)揮促心肌纖維化作用，circRNA_100395通過結(jié)合miR-144-3p發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用，且Smad3信號通路介導(dǎo)miR-144-3p參與了circRNA_100395的作用，從而抑制人心房肌成纖維細(xì)胞(HAFs)纖維化相關(guān)基因表達的調(diào)控[25]。

采用miRNA芯片篩選出永久性房顫(permanent atrial fibrillation，pAF)與健康心房組織中表達有顯著差異的miRNAs，結(jié)果顯示miR-144上調(diào)最為明顯(10.44倍)，提示miR-144參與了pAF的發(fā)生及維持[26]。 有研究應(yīng)用熒光定量PCR法檢測高原低壓低氧條件下大鼠血漿中miR-144的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著低壓低氧暴露時間的延長，血漿miR-144表達水平逐漸升高，引起心肌損傷，繼而引發(fā)了一系列CVD的發(fā)生，包括心律失常、心肌梗死、心力衰竭等[27]。

AF及pAF的病理基礎(chǔ)均與心房纖維化密切相關(guān)，miR-144在心房纖維化進程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[28]。因此，隨著對心律失常與miR-144相關(guān)性研究的不斷深入，miR-144有望為心律失常的診療提供潛在靶點。

3 miR-144與先天性心臟病

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是先天性畸形中最常見的類型[29]，約占各種先天性畸形的28%。CHD是指在胚胎發(fā)育時期由于心臟及大血管形成障礙或發(fā)育異常而引起的解剖結(jié)構(gòu)異常，或出生后應(yīng)自動關(guān)閉的通道未能閉合的情形。CHD種類復(fù)雜且繁多，一般分為3種：發(fā)紺型心臟病、左側(cè)堵塞性缺陷及隔膜缺損。臨床常見的類型主要包括房間隔缺損(atrial septal defect，ASD)、室間隔缺損(ventricular septum defect，VSD)及法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)等。CHD發(fā)病原因較多，遺傳因素僅占8%，而絕大多數(shù)則為環(huán)境因素所致。miRNA表達譜分析可檢測到多種miRNAs在CHD中的表達發(fā)生變化，它們在心力衰竭、心律失常、心肌重構(gòu)、心肌細(xì)胞生長分化及心臟發(fā)育等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[30-32]。

目前認(rèn)為TBX1基因是CHD的核心基因之一，但關(guān)于TBX1基因表達異常的研究較少。Cao等[33]研究發(fā)現(xiàn)，miR-144通過JAK2/STAT1途徑靶向TBX1調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖及凋亡。VSD是最常見的CHD，Li等[34]發(fā)現(xiàn)，與對照組兒童相比，VSD患兒心臟組織中miRNAs表達有顯著變化。 TOF是存活嬰兒中最常見的青紫型CHD，Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)，與非配對捐贈心臟對照相比，TOF患兒心臟標(biāo)本中有47個表達顯著變化的miRNAs，包括miR-144，其中16個表達下調(diào)，31個表達上調(diào)。已證實雙鏈復(fù)合蛋白8(paired box gene 8，Pax-8)參與了胚胎的心臟發(fā)育過程，與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。在Pax-8基因敲除小鼠中，心臟出現(xiàn)VSD，心臟左心室壁及室間隔部位的心肌細(xì)胞存在明顯的凋亡現(xiàn)象；通過篩選Pax-8基因敲除小鼠的miRNA表達譜，結(jié)合RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)miR-144明顯上調(diào)，提示miR-144為促進心肌細(xì)胞凋亡的基因，并推測其參與了Pax-8基因敲除小鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因斑馬魚高表達miR-144可明顯影響胚胎內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育，胚胎節(jié)間血管(intersegmental blood vessel，ISV)生成嚴(yán)重受阻，miR-144靶向meis1基因表達在斑馬魚胚胎血管發(fā)育中有著重要的生物學(xué)功能[37]。 有學(xué)者將miR-144 mimics轉(zhuǎn)染至大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2使其高表達miR-144，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后caspase-3活性明顯升高，而細(xì)胞增殖明顯降低，細(xì)胞凋亡明顯增加，推測miR-144可能通過增加caspase-3表達而促進心肌細(xì)胞凋亡，并抑制心肌細(xì)胞增殖[38]。miRNA可作為無創(chuàng)生物標(biāo)志物應(yīng)用于預(yù)測小兒CHD患者術(shù)后心肌損傷的程度及預(yù)后[39]。 孕婦孕前糖尿病(maternal pregestational diabetes mellitus，PGDM)會誘發(fā)胎兒CHD，PGDM誘導(dǎo)CHD的分子機制尚不清楚，生物信息學(xué)分析表明，PGDM明顯改變了包括miR-144在內(nèi)的149個miRNAs的表達，且發(fā)現(xiàn)了2111個與心臟發(fā)育途徑相關(guān)的miRNAs靶基因，為進一步研究PGDM誘導(dǎo)CHD的分子機制提供了理論依據(jù)。

4 總結(jié)與展望

CVD是導(dǎo)致人類死亡的重要因素，約1/4的死亡與心臟疾病相關(guān)[40]。而miRNA作為一類新型基因調(diào)控小分子，在CVD各種生物學(xué)過程中具有舉足輕重的作用。miRNA是目前研究最為廣泛的一類內(nèi)源性非編碼RNA，人類20%～30%的基因轉(zhuǎn)錄受miRNA的調(diào)控。miRNA廣泛參與了各個系統(tǒng)不同疾病的發(fā)生、發(fā)展，在CVD中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。對miRNA的研究最早始于1993年Lee等[41]在秀麗隱形線蟲中發(fā)現(xiàn)的miRNA lin-4，之后Reinhart等[42]發(fā)現(xiàn)了miRNA let-7及其調(diào)控基因，至此才引起人們對miRNA的高度關(guān)注。成熟miRNA序列很短(18～25個核苷酸)，且具有家族序列高度相似及低表達的特點。miRNA在病理狀態(tài)下的差異表達、穩(wěn)定性及組織特異性使其具有作為生物標(biāo)志物的優(yōu)勢。隨著生命科學(xué)研究的不斷進步和發(fā)展，越來越多與疾病相關(guān)的功能性miRNA被發(fā)現(xiàn)和驗證。

生物信息學(xué)預(yù)測分析miR-144序列高度保守，在參與調(diào)控信號通路過程中功能相對穩(wěn)定，高度保守性決定了miR-144作為生物標(biāo)志物的前提。miR-144在疾病中的調(diào)控作用研究主要集中在調(diào)控紅系分化及腫瘤等領(lǐng)域，在心血管系統(tǒng)的報道相對較少。通過查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，miR-144在CVD中的研究主要集中在膽固醇代謝、心肌細(xì)胞增殖和凋亡，以及心肌細(xì)胞纖維化等方面。miR-144在心肌細(xì)胞中高表達，可促進心肌氧化應(yīng)激，從而誘發(fā)心肌損傷相關(guān)疾病。Pickard等[43]提出，最有前景且具有實驗證據(jù)的心肌保護因子是基質(zhì)衍生因子1α(stromal derived factor 1α，SDF-1α)、一氧化氮及miR-144，對肢體實施遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)，則以上3種物質(zhì)在血漿中濃度明顯升高，而阻斷這些因子可去除遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的心肌保護作用。遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)及靜脈內(nèi)注射miR-144可明顯減少急性I/R模型小鼠的心肌梗死面積[44]。miR-144通過靶向Rac-1改善線粒體的生物發(fā)生并減少細(xì)胞凋亡，從而保護心臟免受高血糖造成的損傷[45]。在小型豬心肌梗死模型中鑒定出84個與對照組表達有差異的miRNAs，且miR-144-3p在梗死區(qū)域的表達更高，miR-144-3p通過靶向PTEN增強心肌梗死后的心臟纖維化[46]。miR-144可能通過波形蛋白信號傳導(dǎo)而調(diào)控AS的發(fā)展[37]。上述研究充分說明miR-144與CVD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-144通過調(diào)節(jié)脂類代謝、抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進心肌纖維化等參與了CVD的發(fā)生發(fā)展進程。

人的機體是一個復(fù)雜的體系，目前大多數(shù)研究只停留在單純分析miR-144及其靶基因在某種疾病中的作用，且其研究方法均為通過生物信息學(xué)軟件來預(yù)測miR-144靶基因，然后在細(xì)胞水平進行驗證，但在體內(nèi)的驗證實驗相對較少，尚不能全面系統(tǒng)地反映miR-144在體內(nèi)的整體調(diào)控作用。大量實驗證據(jù)表明，疾病的發(fā)生發(fā)展受到眾多miRNAs調(diào)控，miR-144只是miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個節(jié)點，在不同疾病中其表達和分布有高低之分，發(fā)揮的作用也有主次之別。已證實miR-144在心血管系統(tǒng)生理過程和正常發(fā)育以及CVD發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此，miR-144具備診斷及預(yù)測CVD的潛力。但miR-144作為CVD生物標(biāo)記物也存在一些不足和弊端，如miR-144在CVD中發(fā)揮主要作用的同時，其他miRNA與miR-144的協(xié)調(diào)作用也會對CVD產(chǎn)生間接影響。miR-144水平的變化可能與特定的心臟病理生理機制存在交叉作用有關(guān)。miR-144作為CVD診斷和預(yù)后分析的生物標(biāo)記物的有效性和安全性有待進一步考證。隨著生物預(yù)測軟件匹配度及準(zhǔn)確性的提高以及高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，通過系統(tǒng)的實驗逐步完善miR-144在CVD中作用的研究，全面了解miR-144在CVD中發(fā)揮的調(diào)控機制，將miR-144作為診療CVD的新靶點指日可待。