適配體生物傳感器在生物分子及細胞檢測中的應(yīng)用研究

劉 暢， 劉 飛， 舒麗瓊， 錢 丹， 田 野， 蒲曉允

（陸軍軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院檢驗科，重慶 400037 ）

在細胞生命的發(fā)展進程中，核酸分子、蛋白質(zhì)等生物分子在遺傳信息的傳遞及表達中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。已有大量的生物分子被確定為許多疾病診斷的潛在生物標志物。在疾病的預(yù)測、診斷及治療中，實現(xiàn)對相關(guān)生物分子的精準、快速檢測已成為研究者關(guān)注的熱點。在疾病發(fā)生早期，與疾病相關(guān)的生物標志物均痕量存在于復(fù)雜的機體環(huán)境中，因此建立高特異性、高敏感性的檢測技術(shù)是關(guān)鍵。隨著材料學、生物信息學的發(fā)展，生物傳感器技術(shù)已成為多學科交叉的新興技術(shù)。目前，在眾多生物傳感檢測系統(tǒng)中，適配體生物傳感器以適配體作為新型的分子識別探針，與生物傳感器結(jié)合，具有特異性好、制備簡單、穩(wěn)定、易于修飾等特點，在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。本文對適配體生物傳感器在生物分子檢測領(lǐng)域的應(yīng)用作一綜述。

1 核酸適配體概述

適配體是通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)從體外合成的單鏈寡核苷酸文庫中反復(fù)篩選獲得的DNA或RNA寡核苷酸單鏈[2]。這些單鏈寡核苷酸序列由20～80個堿基組成，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能與多種生物分子結(jié)合，包括小分子物質(zhì)、酶、多肽、金屬離子、細胞等。

適配體在生物分析化學、蛋白質(zhì)組學、臨床醫(yī)學、藥物研發(fā)、基因調(diào)控及食品安全等領(lǐng)域已經(jīng)成為重要的研究工具[3-5]。適配體在適配體傳感器中作為分子特異性識別物質(zhì)與檢測靶分子結(jié)合，具有獨特的優(yōu)點。適配體作為DNA或RNA的寡核苷酸片段，其相對分子質(zhì)量小，與作用分子結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)位阻較小，利于其他活性物質(zhì)的修飾及固定。適配體作為寡核酸片段適用范圍廣，能與單鏈DNA結(jié)合，可以與金屬離子、氨基酸、核苷酸、糖類、維生素等生物小分子及抗體、酶、生長因子等生物大分子結(jié)合，甚至還能與細菌、病毒、細胞等靶分子相互作用。

2 適配體生物傳感器

目前，生物傳感技術(shù)在核酸、蛋白質(zhì)、病原菌、細胞等生物分子的快速檢測中被廣泛應(yīng)用。生物傳感器作為核酸適配體的重要應(yīng)用領(lǐng)域，為眾多研究者所關(guān)注。

適配體生物傳感器是以DNA或RNA適配體作為感受器表面的識別元件，將適配體通過各種方法固定于電極表面，適配體與待測靶分子特異性結(jié)合后產(chǎn)生可識別的生物信號，進而通過換能裝置將識別信號轉(zhuǎn)換成可定量檢測的電、光、色等化學信號的新型傳感器。根據(jù)傳感器檢測信號的不同，適配體傳感器可分為電化學適配體傳感器、熒光適配體傳感器、比色適配體傳感器等。

3 適配體生物傳感器在生物分子檢測中的應(yīng)用

3.1 適配體生物傳感器在生物小分子檢測中的應(yīng)用

生物小分子包括氨基酸、糖類化合物、核苷酸、神經(jīng)遞質(zhì)及激素在內(nèi)的物質(zhì)，是組成生物大分子的結(jié)構(gòu)單元和維持生命正常機能的基礎(chǔ)。這些生物小分子含量和活性與人體的健康密切相關(guān)，在生命體的新陳代謝、免疫維持、組織修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用。多巴胺是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，是腎上腺素及去甲腎上腺素合成的前體物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)人體的運動、記憶、情緒等生理功能。多巴胺紊亂會引起帕金森綜合征、精神分裂等疾病。AZADBAKHT等[6]以納米金修飾的聚乙烯亞胺功能化碳納米管為捕獲探針，將其固載于電極表面，結(jié)合上多巴胺-適配體檢測探針，以亞甲基藍（methylene blue，MB）為氧化還原探針，構(gòu)建了電化學適配體傳感器，實現(xiàn)了血清樣本中多巴胺的高敏感性檢測，線性范圍為5～300 nmol/L，最低檢測限為2.1 nmol/L。

腺苷是存在于機體細胞內(nèi)外的一種內(nèi)源性核苷，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成的中間產(chǎn)物，與細胞的代謝狀態(tài)密切相關(guān)，腺苷可作為腫瘤的潛在血清敏感型標志物[7-9]，在腫瘤診斷及治療效果評價中具有臨床實用價值。WANG等[10]報道了一種“signal-off”的電化學適配體傳感器，用于ATP的快速檢測。傳感器通過在電極表面修飾上與ATP適配體部分互補的DNA鏈，借助適配體上的G堿基結(jié)合大量的MB電活性物質(zhì)。當目標待測物（ATP）出現(xiàn)后，適配體與之特異性結(jié)合，并從捕獲探針DNA鏈上解離，使電極表面聚集的MB減少，從而產(chǎn)生減弱的電化學信號，從電化學信號減弱的強度實現(xiàn)ATP的定量測定。JIA等[11]在此研究基礎(chǔ)上，改進并設(shè)計了雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)及插入法以增強電化學信號，構(gòu)建了檢測ATP的適配體傳感器。他們首先設(shè)計了標記有MB的適配體與輔助DNA鏈互補的雙發(fā)夾DNA探針，并固定于電極表面，由于每個雙發(fā)卡DNA探針標記有2個MB，因此在電極表面可以檢測到較強的電流信號。當待檢樣本中有ATP存在時，適配體與ATP結(jié)合，探針雙發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，適配體鏈末端的MB及輔助DNA鏈均脫離電極表面，產(chǎn)生明顯降低的電化學信號，通過檢測電流信號的降低，實現(xiàn)ATP的高靈敏檢測，線性范圍達到5～1 000 nmol/L。GAO等[12]報道了用于ATP檢測的納米金適配體比色傳感器。他們設(shè)計了H1、H2 2條帶有黏性末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針，發(fā)夾探針通過黏性末端與納米金結(jié)合，在一定鹽濃度下，阻止了納米金的聚集。在ATP存在的條件下，含有ATP適配體序列的H1發(fā)夾探針特異性識別靶分子，打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。同時單鏈H1探針作為引發(fā)劑，與H2探針相互作用，進行雜交鏈式反應(yīng)，從而脫離納米金粒子表面，使納米金粒子發(fā)生聚集，產(chǎn)生由紅色到藍色變化的顏色反應(yīng)。構(gòu)建的傳感器操作簡便，無需標記，最低檢測限為1.0 nmol/L。

3.2 適配體生物傳感器在腫瘤標志物檢測中的應(yīng)用

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細胞會合成并分泌與疾病密切相關(guān)的標志物。當腫瘤存在或發(fā)生時，這些腫瘤標志物在人體血液、體液或組織中的含量會發(fā)生異常改變。前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）是前列腺癌特異性的血清標志物。ZHAO等[13]以PSA為檢測靶分子，構(gòu)建了一種基于發(fā)夾探針誘導(dǎo)的目標循環(huán)及雙金屬催化信號放大的電化學適配體傳感器。他們設(shè)計合成了PSA-適配體互補探針并自組裝于磁性納米粒子表面，構(gòu)建了金-鉑-亞甲基藍（AuNPsplatinum-methylene blue，Au/Pt-PMB）納米復(fù)合物標記的檢測探針，同時將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的捕獲探針固定于電極表面。當待測樣本中存在PSA時，適配體會特異性識別并結(jié)合PSA，使適配體互補探針從雙鏈DNA解離，并與電極表面的捕獲探針結(jié)合，在輔助探針的作用下，引發(fā)DNA探針的循環(huán)擴增。標記有Au/Pt-PMB復(fù)合物的檢測探針與捕獲探針互補結(jié)合后，通過Au/Pt-PMB對H2O2的催化，高靈敏地檢測PSA。構(gòu)建的傳感器線性范圍寬，靈敏度高，檢測線性為10 fg/mL～100 ng/mL，最低檢測限為2.3 fg/mL，牛血清白蛋白、免疫球蛋白等物質(zhì)對傳感器的檢測結(jié)果無明顯干擾。JALALVAND等[14]報道了基于納米金-碳60-殼聚糖-電解液-多壁碳納米管（AuNPs-fullerene C60-chitosan-ionic liquid-multiwalled carbon，AuNPs-C60-CS-IL-MWCNTS）修飾的PSA-適配體絲網(wǎng)印刷電極，通過測定PSA與適配體特異性結(jié)合前后電極表面電化學阻抗值的變化，實現(xiàn)了樣本中PSA的微型化定量檢測，檢測線性為1 pg/mL～ 200 ng/mL，最低檢測限為0.5 pg/mL。

血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一種參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的血管生長因子，與食道癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤密切相關(guān)。CHANG等[15]將納米金結(jié)合分支鏈DNA擴增技術(shù)構(gòu)建了比色適配體傳感器。該技術(shù)通過擴增反應(yīng)制備了DNA樹枝狀納米結(jié)構(gòu)的捕獲探針，在納米金促進鹽誘導(dǎo)聚集作用下，信號級聯(lián)放大，實現(xiàn)了對PDGF的高靈敏定量測定。ZHANG等[16]研制了一種基于H2O2酶功能化的網(wǎng)狀DNA-鉑納米粒子（platinum nanoparticle，PtNP）信號放大的適配體電化學傳感器，其方法是通過適配體DNA鏈的雜交結(jié)合，在電極表面自組裝形成H2O2酶功能化的鉑納米籠，在六氨合釕[hexaammineruthenium（Ⅲ） chloride，RuHex]吸附PtNPs的協(xié)同催化作用下，極大地提高了RuHex的電化學檢測信號。該研究進一步推進了適配體傳感器在腫瘤標志物檢測中的應(yīng)用。

3.3 細胞因子的檢測應(yīng)用

細胞因子是由T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞等免疫細胞刺激分泌的具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)。細胞因子在參與細胞免疫調(diào)節(jié)的過程中，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、炎癥作用等密切相關(guān)。YIN等[17]報道了一種基于石墨烯-納米金修飾電極，雙酶催化信號放大的電化學適配體，用于細胞因子干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）的高靈敏檢測。他們設(shè)計合成了捕獲探針，與適配體互補形成雙鏈，固載于石墨烯-納米金修飾的電極表面。當待測樣本中存在IFN-γ，適配體從捕獲探針解離，與IFN-γ特異性識別并結(jié)合。在核酸外切酶RecJf的作用下，適配體被剪切，IFN-γ被重新釋放，實現(xiàn)目標物循環(huán)的信號放大。以連接探針作為引發(fā)劑，電極表面的單鏈捕獲探針與生物素標記的發(fā)夾探針進行雜交鏈式反應(yīng)，使電極表面獲得大量生物素標記的雙鏈聚合物，通過與親和素標記的辣根過氧化物酶結(jié)合，利用辣根過氧化物酶的催化作用完成IFN-γ的定量檢測。YIN等[17]構(gòu)建的傳感器具有較好的選擇性及穩(wěn)定性，線性范圍為5 pmol/mL～5 nmol/mL，最低檢測限為2 pmol/L（信噪比=3），與酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELLSA）方法相比，回收率達91.3%～107.7%，2種方法的相對標準偏差為4.21%～5.54%。XIA等[18]構(gòu)建了一種IFN-γ與溶菌酶（lysozyme，Lys）同步檢測的“signal-off（或signal-on）”型電化學適配體傳感器，他們設(shè)計合成了二茂鐵（ferrocene，F(xiàn)c）及MB標記的2種信號探針固定于金電極表面。2種信號探針能分別與IFN-γ及Lys的適配體互補結(jié)合，形成雙鏈DNA聚合物。當待測樣本中存在IFN-γ或Lys時，適配體會特異性識別靶分子，從雙鏈DNA聚合物解離，進而使固定于電極表面的檢測探針發(fā)生構(gòu)型改變，使標記的電活性物質(zhì)Fc及MB遠離或靠近電極，產(chǎn)生一組強度相反的電化學信號，實現(xiàn)2種生物分子的同步檢測。該傳感器檢測IFN-γ及Lys的最低檢測限分別為1.14×10-3nmol/L及 0.016 4 nmol/L。

3.4 適配體生物傳感器在病原微生物檢測中的應(yīng)用

病原微生物包括細菌、病毒、支原體、衣原體等。目前，臨床上常規(guī)的病原微生物檢測技術(shù)為分離培養(yǎng)法，再通過一系列生化實驗對分離菌進行鑒定。但這種分離培養(yǎng)的鑒定方法操作復(fù)雜，耗時長（5～7 d），難以滿足臨床對感染性疾病快速、及時的診斷和治療的要求。

目前，采用適配體篩選技術(shù)針對細菌表面特定的純化蛋白、細胞裂解蛋白等進行篩選，可獲得適配體的細菌主要有沙門菌、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等。YAN等[19]利用甲型副傷寒沙門菌適配體高特異的識別特性，以5-羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）與SYBR Green I作為熒光分子，氧化石墨烯（graphenoxid，GO）作為熒光淬滅劑，構(gòu)建了檢測腸炎沙門菌的適配體傳感器。當檢測體系中無待檢病原菌時，適配體熒光探針被吸附到GO表面，使熒光被淬滅。當檢測體系中出現(xiàn)待檢菌后，沙門菌與適配體特異性識別并與之結(jié)合，適配體探針從GO上釋放出來，產(chǎn)生熒光信號。在Klenow酶的作用下，與延伸探針3'端雙鏈的適配體結(jié)合，同時置換下目標菌，實現(xiàn)目標物的循環(huán)利用使信號放大，同時結(jié)合FAM和核苷酸膠體染液協(xié)同信號放大，使熒光增強，極大地提高了檢測敏感性，使敏感性達3×102CFU/mL。HASAN等[20]利用全菌體沙門菌適配體高特異的識別特性，將氨基修飾的DNA適配體固定在多壁碳納米管-ITO電極表面，通過檢測適配體和菌體結(jié)合前后電流峰值的變化，實現(xiàn)對鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的高靈敏檢測，在優(yōu)化的實驗條件下，最低檢測限分別為55和67 CFU/mL。

目前，針對病毒表面不同的結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白篩選出來的病毒適配體有肝炎病毒適配體、流感病毒適配體等。隨著適配體傳感器技術(shù)的發(fā)展，新的檢測方法已應(yīng)用于病毒的檢測。GHANBARI等[21]報道了一種操作簡便、響應(yīng)快速的電化學阻抗型適配體傳感器，可用于丙型肝炎病毒的檢測。該適配體傳感器采用石墨烯量子點修飾玻碳電極，以固定于電極表面的丙型肝炎病毒核心蛋白適配體捕獲目標病毒，通過電極表面電化學阻抗值的變化實現(xiàn)對丙型肝炎病毒的檢測，最低檢測限為3.3 pg/mL。XI等[22]利用乙型肝炎病毒表面抗原特異性適配體，構(gòu)建了一種電化學發(fā)光的新型適配體傳感器。該傳感器通過構(gòu)建納米金/四氧化三鐵/二氧化硅適配體磁性探針，通過檢測電化學發(fā)光信號，定量測定血清乙型肝炎病毒表面抗原，與傳統(tǒng)的ELLSA相比，檢測敏感性得到了極大提高，最低檢測限為0.05 ng/mL。

3.5 適配體生物傳感器在細胞檢測中的應(yīng)用

現(xiàn)階段外周血中循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的檢測對于乳腺癌、白血病等的診斷、治療和預(yù)后評價具有十分重要的意義[23-25]。細胞核酸適配體為適配體傳感器在腫瘤細胞檢測中的應(yīng)用提供了新的思路和有效方法。SHENG等[26]的研究結(jié)果顯示，乳腺癌細胞適配體探針與MCF-7細胞特異性結(jié)合后可引發(fā)構(gòu)型變化，暴露黏性末端，進而與鏈霉素、親和素、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）形成雜交雙鏈，在聚合酶輔助下經(jīng)過滾環(huán)擴增，通過HRP催化導(dǎo)電聚苯胺，產(chǎn)生急劇增大的電流信號，實現(xiàn)對MCF-7細胞的高靈敏檢測。YU等[27]報道了一種用于白血病細胞K562檢測的適配體傳感器新方法。該傳感器利用適配體捕獲K562細胞至電極表面，通過生物素標記的刀豆蛋白A探針與K562細胞結(jié)合，然后與鏈酶親和素標記的堿性磷酸酶結(jié)合，通過堿性磷酸酶對底物α-萘酚（alpha-naphthol，α-NP）的催化產(chǎn)生明顯的電化學活性信號，從而實現(xiàn)對K562細胞的高靈敏檢測。

4 展望

將適配體作為新型的分子識別元件與生物傳感技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建的適配體生物傳感器結(jié)合了適配體高特異性、親和力、穩(wěn)定性的優(yōu)勢，同時具備生物傳感器響應(yīng)快速、便捷、靈敏、成本低廉的特點?；谶m配體技術(shù)的電化學、光學等生物傳感器已被廣泛應(yīng)用于靶向檢測、疾病診斷、藥物篩選等領(lǐng)域中，實現(xiàn)對多種生物分子的痕量超敏檢測，展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿皬V闊的應(yīng)用前景。

目前，市場上還沒有將核酸適配體作為檢測手段的產(chǎn)品上市，適配體生物傳感器應(yīng)用于生物檢測還存在不足，主要在于：（1）基于多種生物分子同步檢測的適配體生物傳感器模型較少。由于適配體篩選技術(shù)的高度特異性，限制了作為分子識別元件的適配體探針實現(xiàn)多種生物分子的快速檢測。因此實現(xiàn)多種生物分子的高通量快速檢測是適配體傳感器發(fā)展的重要方向。（2）針對不同生物分子，如細菌、細胞、蛋白質(zhì)等的適配體種類有限。開發(fā)更為簡單、精準的適配體篩選技術(shù)將推動適配體傳感器的快速發(fā)展。（3）以建立非標記適配體傳感器技術(shù)為研究方向?，F(xiàn)階段一些熒光、電活性物質(zhì)等對適配體的標記均會對適配體的特異性及靶分子的親和性產(chǎn)生影響，因此，非標記適配體傳感器技術(shù)的研究已成為眾多學者關(guān)注的重點。

綜上所述，隨著適配體篩選技術(shù)、生物傳感技術(shù)的飛速發(fā)展，基于適配體的生物傳感器檢測方法在生物分子檢測領(lǐng)域?qū)懈鼜V闊的發(fā)展及應(yīng)用潛力。