酶聯(lián)免疫法檢測中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中的酶殘留量

李海波，李康強(qiáng)，蔡鴻飛，龍海林，袁誠，許文東，張懿，楊陽

技術(shù)與方法

酶聯(lián)免疫法檢測中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中的酶殘留量

李海波，李康強(qiáng)，蔡鴻飛，龍海林，袁誠，許文東，張懿，楊陽

510240 廣州，中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心/廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司

中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯是一種應(yīng)用度較高的改性油脂，既避免了中鏈甘油三酯易引起酸中毒和酮血癥狀，又克服了長鏈甘油三酯免疫功能方面的缺陷和吸收緩慢的缺點(diǎn)[1-2]。中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯在一定程度上彌補(bǔ)了單一脂肪酸的供能和營養(yǎng)性上的缺點(diǎn)，也有利于氮平衡和提高單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能、減輕免疫系統(tǒng)并發(fā)癥[2-3]。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和酶法等[4]。化學(xué)法往往存在著有機(jī)溶劑用量較多、反應(yīng)溫度高、產(chǎn)物難以控制等缺點(diǎn)。而酶法合成過程反應(yīng)條件溫和，安全性好，產(chǎn)物專一性強(qiáng)，能合成特殊的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，可以滿足消費(fèi)者在醫(yī)療和營養(yǎng)方面的需要，故酶法在中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯的合成應(yīng)用中逐漸成為研究的熱點(diǎn)[5]。

脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，可催化由不同底物組成的水解和合成反應(yīng)。中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯催化合成結(jié)束后需要除去脂肪酶，否則在長期存放的過程中，脂肪酶會催化酯鍵水解，導(dǎo)致游離脂肪酸的增多，以及分子內(nèi)的中長鏈殘基發(fā)生變化，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性[6-7]。另外還會提高人體對中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯過敏的風(fēng)險(xiǎn)。目前，脂肪酶的測定方法有平板法（主要應(yīng)用于產(chǎn)脂肪酶菌種的篩查及批量酶樣品的快速測定，但誤差較大、耗時長），滴定法（適用于乳制品中脂肪酶活力的測定，但耗時長、誤差大、會有假陽性結(jié)果、判斷滴定終點(diǎn)困難），色譜法（適用于脂肪酶的確證及活性精確定量，但設(shè)備昂貴，不適用于大量樣品）[8-11]。國內(nèi)外尚未有關(guān)于甘油三酯中的低含量脂肪酶檢測的報(bào)道，本研究通過制備脂肪酶抗體-脂肪酶抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，與 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）反應(yīng)顯色的原理，建立中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中酶殘留量的酶聯(lián)免疫測定法，并重點(diǎn)驗(yàn)證該檢測方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性，以期為監(jiān)控中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯的質(zhì)量穩(wěn)定性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Multiskan FC 酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司；BJPX 生化培養(yǎng)箱購自山東博科科學(xué)儀器有限公司；CS-101-A電熱鼓風(fēng)干燥箱購自上海昕儀儀器儀表有限公司。

脂肪酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司；中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯樣品經(jīng)酶法酯交換反應(yīng)實(shí)驗(yàn)制備所得。

1.2 方法

1.2.1 抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物的制備及顯色反應(yīng) 采用純化的脂肪酶抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入脂肪酶，再與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的脂肪酶抗體結(jié)合，形成脂肪酶抗體-脂肪酶抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。

1.2.2 中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中酶殘留量檢測方法的建立

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出后室溫平衡 15 ~ 30 min，以 150 μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度為 32 ng/L 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對倍稀釋 4 次，使終濃度分別為 32、16、8、4、2 ng/L。分別在酶標(biāo)包被板上設(shè)置空白孔（空白對照孔不加標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔，并記錄位置。在標(biāo)準(zhǔn)品孔上準(zhǔn)確加樣 50 μl，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，用封板膜封板后置 37 ℃溫育 30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 s 后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外。重復(fù)溫育和洗滌操作，每孔先加入顯色劑 A 50 μl，再加入顯色劑 B 50 μl，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色 10 min。每孔加終止液 50 μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的值。測定應(yīng)在加終止液后 15 min 以內(nèi)進(jìn)行。

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，將樣品的值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.2.2.2 方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.2.3 樣品脂肪酶測定 中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯樣品經(jīng)過濾等預(yù)處理后，用樣品稀釋液稀釋 5 倍，取 50 μl 樣品加于酶標(biāo)板樣品孔，其他步驟與 1.2.1 操作步驟相同。測定后各孔的值減去空白孔的平均值，計(jì)算平均值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得到中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯樣品中脂肪酶的濃度。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，空白孔調(diào)零，標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 1）。脂肪酶在 1.0 ~ 32 ng/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：y = 0.0368x + 0.0130，相關(guān)系數(shù)2= 0.9990。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 脂肪酶準(zhǔn)確性與回收率實(shí)驗(yàn) 如表 1 所示，酶聯(lián)免疫法檢測脂肪酶的回收率分別為 100.81%、96.01%、101.43%、95.52%，范圍均在 100% ± 10% 以內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 分別為 1.24%、2.30%、1.62%、3.32%，RSD 值均小于 5%，說明本研究方法檢測中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中脂肪酶的準(zhǔn)確性和回收率較好，并且穩(wěn)定性較好[12]。

圖 1 脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中的脂肪酶含量檢測

中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯樣品經(jīng)過預(yù)處理后，稀釋加樣檢測，將值按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中脂肪酶的含量。樣品 S3 脂肪酶含量為 3.53 ng/L，樣品 S4 脂肪酶含量為 6.11 ng/L，樣品 S5 脂肪酶含量為 5.02 ng/L，經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證后，中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中脂肪酶殘留量在合理范圍內(nèi)。

3 討論

酶催化合成法是中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯制備的常用方法。中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯具有優(yōu)越的營養(yǎng)特性和健康功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、特殊營養(yǎng)等領(lǐng)域，但同時對其質(zhì)量要求也越來越嚴(yán)格。中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中殘留的脂肪酶不僅增加人體致敏性風(fēng)險(xiǎn)，還會水解甘油三酯，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性[13]。因而，中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中的脂肪酶殘留量是其不可或缺的重要檢測指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，脂肪酶濃度范圍在 1.0 ~ 32 ng/L 線性較好，方法學(xué)驗(yàn)證表明其重復(fù)性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和回收率較好，適用于檢測中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中的脂肪酶殘留量。

表 1 準(zhǔn)確性與回收率實(shí)驗(yàn)

表 2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表 3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

傳統(tǒng)的脂肪酶含量檢測方法存在難以檢測低濃度，與酶聯(lián)免疫法相比，價格昂貴，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)[14]。本研究采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)顯色原理建立檢測中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中脂肪酶的方法，免疫學(xué)檢測方法通常具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷的特點(diǎn)[15]。本方法與平板法、色譜法和熒光分析法相對比，在確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高的同時，實(shí)驗(yàn)操作簡單，貴重儀器少，樣品用量少，檢測限較低。本方法可為脂肪酶的高通量、方便快捷的現(xiàn)場檢測提供技術(shù)支撐，為中長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯的質(zhì)量控制、研究開發(fā)提供科學(xué)檢測手段。

[1] Shou JF. Study on enzymatic synthesis and purification of medium/long chain fatty acid triglycides (MLM-type structured lipids). Hefei:Hefei University of Technology, 2012. (in Chinese)

壽佳菲. 中長鏈脂肪酸甘油三酯的酶法制備與分離純化研究. 合肥:合肥工業(yè)大學(xué), 2012.

[2] Zhou F, Wang JY, Bai XF, et al. Progress in medium-and long-chain triacylglycerol. China Oils Fats, 2018, 43(7):67-71, 81. (in Chinese)

周飛, 王建宇, 白雪斐, 等. 中長碳鏈甘油三酯的研究進(jìn)展. 中國油脂, 2018, 43(7):67-71, 81.

[3] Takeuchi H, Sekine S, Kojima K, et al. The application of medium-chain fatty acids:edible oil with a suppressing effect on body fat accumulation. Asia Pac J Clin Nutr, 2008, 17 Suppl 1:320-323.

[4] Kim BH, Akoh CC. Recent research trends on the enzymatic synthesis of structured lipids. J Food Sci, 2015, 80(8):C1713-C1724.

[5] Pu FL, Sun WF, Che ZM. Research and development progress of functional oils. Cereals Oils, 2016, 29(8):5-8. (in Chinese)

蒲鳳琳, 孫偉峰, 車振明. 功能性油脂研究與開發(fā)進(jìn)展. 糧食與油脂, 2016, 29(8):5-8.

[6] Gao W, Yang LC, Hong K, et al. Study on the hydrolysis characteristics of oil by TLIM lipase. Cereals Oils Processing, 2010, (4):15-18.(in Chinese)

高巍, 楊立昌, 洪鯤, 等. TLIM脂肪酶對油脂水解特性的研究. 糧油加工, 2010, (4):15-18.

[7] Li Y, Pan YG, Lian Y. Studies on catalysis and properties of microbial lipases. J Cereals Oils, 2005, (10):15-17. (in Chinese)

李燕, 潘運(yùn)國, 連毅. 微生物脂肪酶催化及其性質(zhì)研究進(jìn)展. 糧食與油脂, 2005, (10):15-17.

[8] Wu MC, Sun CR, Wu XZ. Diffusion plate assay for quick and rough estimation of alkaline lipase activity. J Wuxi Univ Light Industry, 2000, 19(2):168-172. (in Chinese)

鄔敏辰, 孫崇榮, 鄔顯章. 平板擴(kuò)散法粗略確定堿性脂肪酶的活性. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 19(2):168-172.

[9] Liu CH, Chen WM, Chang JS. Methods for rapid screening and isolation of bacteria producing acidic lipase:feasibility studies and novel activity assay protocols. World J Microbiol Biotechnol, 2007, 23(5):633-640.

[10] Krewinkel M, Baur C, Kranz B, et al. A sensitive and robust method for direct determination of lipolytic activity in natural milk environment. Food Anal Methods, 2016, 9(3):646-655.

[11] Tao Y, Zhang Y, Wang Y, et al. Hollow fiber based affinity selection combined with high performance liquid chromatography-mass spectroscopy for rapid screening lipase inhibitors from lotus leaf. Anal Chim Acta, 2013, 785(12):75-81.

[12] Li BL, Yang GX, Gu L. Detection of fluoranthene in marine shellfish by ELISA. Chin J Anal Lab, 2019, 38(2):196-201. (in Chinese)

李冰蓮, 楊光昕, 谷麟. 酶聯(lián)免疫法檢測海洋貝類中的熒蒽. 分析試驗(yàn)室, 2019, 38(2):196-201.

[13] Zhou SM. Study on enzymatic synthesis, safety evaluation and weight loss of fatty acid lipids. Shanghai:Shanghai Jiao Tong University, 2017. (in Chinese)

周盛敏. 中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂的酶法合成、安全性評價及減肥功能研究. 上海:上海交通大學(xué), 2017.

[14] Xu ML, You CP, Gao HY, et al. Progress in determination of lipase activity of Psychrotrophs in milk. China Dairy Industry, 2018, 46(8):25-28. (in Chinese)

徐明亮, 游春蘋, 高海燕, 等. 乳中耐冷菌脂肪酶活性測定方法進(jìn)展. 中國乳品工業(yè), 2018, 46(8):25-28.

[15] Shi CY. Research progress in the detection of aflatoxins in foods. AEM Roducts Rocessing, 2019, (14):86-89. (in Chinese)

史春悅. 食品中黃曲霉毒素檢測技術(shù)的研究進(jìn)展. 農(nóng)產(chǎn)品加工(下半月), 2019, (14):86-89.

廣州市科技創(chuàng)新人才專項(xiàng)（201710010131）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)（2017YFC1703100）

蔡鴻飛，Email：caihf@byshf.com

2019-08-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.012