胺碘酮對心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流變化研究

王增夏，解金紅，王 賀，趙亞楠，曹英杰，關(guān)懷敏

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一，房顫可導(dǎo)致心房內(nèi)血栓及腦卒中等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，并且會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[1]。房顫發(fā)病機制尚不完全清楚，電重構(gòu)、氧化應(yīng)激在房顫的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[2]，L型鈣通道(L-type calcium channel, ICa-L)[3]是心臟電活動中的重要離子通道之一，是構(gòu)成動作電位二期平臺期的重要離子流。胺碘酮是經(jīng)典的Ⅲ類抗心律失常藥物，對多種離子通道，如鈉通道、鉀通道、鈣通道均有阻滯作用。該研究在于明確H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及胺碘酮對大鼠心房肌細(xì)胞L型鈣通道電流(L-type calcium channel current,ICaL)的影響，為闡明房顫機制提供細(xì)胞分子水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與溶液、試劑動物選取清潔級成年雄性SD大鼠由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，體質(zhì)量280～320 g，動物實驗方法通過我國動物倫理學(xué)的規(guī)定。胺碘酮、10 mol/L H2O2、TEA-Cl、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；膠原酶Ⅱ購于美國Gibco公司；NaH2PO4、HEPES、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、?；撬?Taurine)、EGTA、Mg-ATP、CsCl購于北京索萊寶科技有限公司；CaCl2購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

無鈣臺式液成分：NaCl 136 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、NaH2PO4·2H2O 0.33 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，用NaOH將pH值調(diào)至7.4。

KB液成分：KOH 80 mmol/L 、KCl 30 mmol/L、L-Glutamic Acid 50 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、KH2PO420 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L，用KOH將pH值調(diào)至7.4。

酶液：20 mgⅡ型膠原酶、10 μl 0.1 mol/L CaCl2加入到無鈣臺式液中，定容至50 ml。

記錄ICaL的細(xì)胞內(nèi)液成分：CsCl 130 mmol/L、MgCl2·6H2O 2 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 15 mmol/L、Mg-ATP 3 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，用CsOH將pH值調(diào)至7.2。

記錄ICaL的細(xì)胞外液成分：TEA-Cl 136 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，用CsOH將pH值調(diào)至7.4。

1.2 成年SD大鼠單個心房肌細(xì)胞的分離采用酶解法分離并制備單個心房肌細(xì)胞[4]。提前將無鈣臺式液、KB液、酶液100%充氧30 min。SD大鼠腹腔注射肝素(200 IU/ml)0.3 ml后，10%水合氯醛(0.30 mg/kg)腹腔注射麻醉。SD大鼠麻醉后，開胸，迅速取出心臟，置于冰無鈣臺式液的培養(yǎng)皿里，用無齒眼科鑷夾住主動脈上緣，逆行插管至主動脈根部，使插管的下緣于肺動脈的起始部在同一水平面上。使用Langendorff恒流灌流裝置[5]，灌流速度5.4 ml/min，在恒溫狀態(tài)下(溫度保持在37.5 ℃)，首先用無鈣臺式液灌流2～3 min，待心臟內(nèi)血液沖洗干凈后，換用酶液灌流，待無鈣臺式液沖洗干凈約2 min后，結(jié)扎上下腔靜脈、肺靜脈，繼續(xù)酶液灌流9～10 min，用眼科鑷輕輕牽拉心房肌，心房肌組織變得松軟，輕輕牽拉沒有阻力時，沿房室間溝將左右心房剪掉，放入KB液中，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的小組織塊，用吸管輕輕吹打約3～5 min，可以看到組織塊拉成絲狀，分離出單個心房肌細(xì)胞，用200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾此KB液，過濾后的細(xì)胞懸液用小燒杯定容至10 ml，為細(xì)胞復(fù)鈣做準(zhǔn)備。用含有對應(yīng)CaCl2濃度的KB液，分次逐步加入到10 ml細(xì)胞懸液中，使其恢復(fù)至生理濃度，具體復(fù)鈣方法如下：10 ml細(xì)胞懸液，第1次2 ml KB液+12 μl 0.1 mol/L CaCl2反復(fù)吹打混勻后緩慢加到細(xì)胞懸液中；每間隔5 min，用同樣方法分別加入16、35、79、94 μl 0.1 mol/L CaCl2于2 ml KB液中，混勻后加入細(xì)胞懸液中。復(fù)鈣結(jié)束后在細(xì)胞培養(yǎng)板中用心肌細(xì)胞培養(yǎng)液鋪板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育，以備后續(xù)膜片鉗實驗使用。

1.3 藥物配制胺碘酮單體用DMSO溶解(DMSO的終濃度不超過0.1%)，加超純水制備成母液，敷藥時稀釋成5 μmol/L的工作液。10 μmol/L H2O2敷藥時稀釋成100 μmol/L工作液[6]。

1.4 心房肌細(xì)胞的處理和藥物的使用細(xì)胞共分為3組：① 對照組：細(xì)胞不經(jīng)過處理直接進(jìn)行膜片鉗實驗，記錄鈣電流(n=15)；② H2O2組：細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)0.5 h后進(jìn)行膜片鉗實驗并記錄電流(n=15)；③胺碘酮組：細(xì)胞預(yù)先經(jīng)100 μmol/L H2O2培養(yǎng)0.5 h后加入5 μmol/L胺碘酮培養(yǎng)0.5 h進(jìn)行膜片鉗實驗并記錄電流(n=18)。

1.5 排除電流干擾為了確保記錄到的鈣電流是純凈鈣電流，在電極內(nèi)液和細(xì)胞外液里均不含有Na+，故排除了Na+電流干擾，并且在上述兩種液體里分別加入CsCl、TEA-Cl故排除了K+電流干擾。心房肌細(xì)胞膜分布了兩種鈣通道，分別為ICa-L和T型鈣通道，該實驗將電壓鉗制在-40 mV，以致T型鈣通道失活，綜上，記錄到的鈣電流是ICaL。

1.6 膜片鉗全細(xì)胞記錄使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)[7]，在電壓鉗制下記錄ICaL。將HEKA EPC-10放大器(德國HEKA公司)與計算機相連接。電壓輸入信號和刺激信號的采集均有軟件PatchMaster控制。玻璃電極(美國Sutter公司)經(jīng)P-97微電極拉制儀(美國Sutter公司)拉制成電阻為2.0～5.0 MΩ的電極[8]。在顯微鏡下挑選外觀完整規(guī)則，邊界清晰，表面光滑無顆粒，立體感強，橫紋清楚，不收縮的梭型細(xì)胞。將玻璃電極充灌好電極內(nèi)液，在玻璃電極插入浴液前，給予輕微的正壓，用三維操縱儀(MP-225，Sutter公司)調(diào)節(jié)玻璃電極的位置使其入液，入液后進(jìn)行液接電位補償，繼續(xù)調(diào)節(jié)電極尖端的位置使其接觸到細(xì)胞表面，輕壓細(xì)胞，撤除正壓，在電極尖端施加小的負(fù)壓，形成高阻封接，待封接電阻達(dá)到2 GΩ以上，進(jìn)行電極電容補償，繼續(xù)負(fù)壓吸引使其破膜形成全細(xì)胞記錄模式，并對全細(xì)胞膜電容進(jìn)行補償。信號經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣頻率為10 kHz。

1.7 ICaL刺激參數(shù)ICa-L的I-V曲線：鉗制電位-70 mV，給予250 ms，階躍10 mV，-60 mV～+60 mV的系列刺激，用每個細(xì)胞的膜電容(Cm)求電流密度(pA/pF)，用電流密度與相應(yīng)測試電壓作圖，得I-V曲線。ICa-L失活曲線刺激程序：鉗制電位-70 mV，給予1 000 ms，階躍10 mV，-60 mV～+40 mV的系列脈沖，每一條件脈沖后再緊跟+10 mV、250 ms的測試脈沖。階躍電壓下相應(yīng)電流標(biāo)準(zhǔn)化后用Boltzmann方程擬合出失活曲線。ICa-L失活后恢復(fù)曲線刺激程序：鉗制電位-70 mV，給予+10 mV、250 ms的刺激，間隔8、12、18、26、39、58、87、130、195、293、439、658、986、1 479 ms后，再給予+10 mV、250 ms的刺激，記錄相應(yīng)電流除以完全恢復(fù)后的最大電流與相應(yīng)的恢復(fù)時間作圖得出恢復(fù)曲線,用單指數(shù)方程擬合[9]。見圖1。

圖1 ICa-L的刺激程序

圖2 SD大鼠心房肌細(xì)胞ICaL的驗證

A：空白組和維拉帕米組(100 μmol/L)去極化到0 mV時的原始電流圖；B：空白組和維拉帕米組電流密度直方圖；與空白組比較：*P<0.05

圖3 各組原始電流圖、直方圖及I-V曲線圖

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理使用Igor、Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用單因素方差分析，Leven檢驗方差齊性，P<0.05時，組間比較采用Dunnett's T3法；反之采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICaL的驗證SD大鼠心房肌細(xì)胞ICaL是通過穩(wěn)態(tài)激活刺激程序刺激記錄出來的，維拉帕米是ICaL的阻斷劑，維拉帕米100 μmol/L幾乎可以完全阻斷該電流，從而確定此電流是ICaL。見圖2。

2.2 各組大鼠心房肌細(xì)胞ICaL密度的比較單因素方差分析F=23.32，P<0.000 1，按α=0.05檢驗水準(zhǔn)，可認(rèn)為各組總體均數(shù)總的有差別；組間的多重比較結(jié)果如下：與空白組比較，H2O2組ICaL密度升高[(-4.99±0.35) pA/pFvs(-6.97±0.60) pA/pF，P<0.05]，H2O2可以使ICaL增加；與H2O2組比較，胺碘酮組ICa-L密度降低[(-6.97±0.60) pA/pFvs(-3.16±0.20) pA/pF，P<0.05]，胺碘酮使ICaL降低。見圖3B。

2.3 各組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-LI-V曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組細(xì)胞在各電壓下電流密度均增大,胺碘酮組細(xì)胞在各電壓下電流密度均減小。說明胺碘酮對ICaL有抑制作用。見圖3C。

2.4 各組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，半激活電壓V1/2從(-11.92±0.68) mV移動到(-14.48±0.65) mV，P<0.05；與H2O2組比較，胺碘酮組ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線向左移動，半激活電壓V1/2從(-14.48±0.65) mV移動到(-16.74±0.70) mV，P<0.05。H2O2、胺碘酮均可以使ICa-L激活加快。見圖4。

圖4 各組ICa-L的穩(wěn)態(tài)激活曲線圖

圖5 各組ICa-L的穩(wěn)態(tài)失活曲線圖

A：空白組、H2O2組和胺碘酮組通道失活50%時條件脈沖電壓下失活曲線的原始電流圖；B：空白組、H2O2組和胺碘酮組失活曲線

圖6 各組恢復(fù)曲線原始圖及ICa-L的失活后恢復(fù)曲線圖

A：空白組恢復(fù)曲線的部分原始電流圖；B：H2O2組恢復(fù)曲線的部分原始電流圖；C：胺碘酮組恢復(fù)曲線的部分原始電流圖；D：空白組、H2O2組和胺碘酮組失活后恢復(fù)曲線圖

2.5 各組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線變化不明顯，半失活電壓V1/2從(-29.42±0.49) mV移動到(-29.12±0.76) mV，P>0.05，說明H2O2對ICa-L的失活影響不大；與H2O2組比較，胺碘酮組ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線明顯向左移動，半失活電壓V1/2從(-29.12±0.76) mV移動到(-42.19±0.65) mV，P<0.05，胺碘酮可以使ICaL失活加快。見圖5。

2.6 各組大鼠心房肌細(xì)胞ICa-L失活后恢復(fù)曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組失活后恢復(fù)曲線左移，ICa-L恢復(fù)時間常數(shù)Tau值從(215.0±19.76) ms減少至(164.9±11.51) ms，P>0.05，H2O2對ICa-L的恢復(fù)影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與H2O2組比較，胺碘酮組恢復(fù)曲線明顯右移，ICa-L恢復(fù)曲線的時間常數(shù)從(164.9±11.51) ms增加至(1 199±42.67) ms，P<0.05，胺碘酮使ICa-L的恢復(fù)時間延長，恢復(fù)變慢。見圖6。

3 討論

氧化應(yīng)激在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮了重要的作用[10]，H2O2可能與缺血、炎癥、心力衰竭的病理過程有關(guān)，炎癥、缺血、心力衰竭與房顫的發(fā)生也有關(guān)系。氧化應(yīng)激不僅導(dǎo)致心房重構(gòu)，也會引起心房電生理的改變。通過用H2O2對心房肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，建立氧化應(yīng)激模型，采用臨床上典型的Ⅲ類抗心律失常藥物胺碘酮對建立的氧化應(yīng)激模型的心房肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對心房肌細(xì)胞電流的影響，從而進(jìn)一步研究胺碘酮對心房肌細(xì)胞ICa-L活性的影響以及其抗心律失常的作用機制。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)能直接觀察細(xì)胞膜的離子通道電流，是研究抗心律失常藥物作用靶點的重要手段。ICa-L是心肌細(xì)胞膜上鈣離子內(nèi)流的重要通道，其在心房電重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。本實驗中，H2O2使ICaL變大，胺碘酮使ICaL變小，胺碘酮對通道的激活、失活、恢復(fù)動力學(xué)特性均有影響。胺碘酮可以影響鈣通道電流從而逆轉(zhuǎn)心房肌細(xì)胞的電重構(gòu)[11]，房顫患者口服胺碘酮后不僅可以有效阻止重構(gòu)的發(fā)生，還可逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的重構(gòu)。因此，胺碘酮發(fā)揮抗房顫作用很可能是通過影響心房肌細(xì)胞電重構(gòu)實現(xiàn)的。胺碘酮的臨床價值受到副作用的限制。阻止重構(gòu)發(fā)生在胺碘酮抗房顫特性中具有潛在的重要價值，這可能為開發(fā)通過預(yù)防房顫相關(guān)重構(gòu)而對抗房顫的新型化合物提供一個有用的范例。