精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層的“超聲-細(xì)胞-基因”組學(xué)

徐輝雄

甲狀腺結(jié)節(jié)診治近年來成為關(guān)注焦點，一些爭議持續(xù)存在。 部分學(xué)者認(rèn)為存在過度診斷與過度治療，也有部分學(xué)者認(rèn)為低估了甲狀腺癌侵襲性［1-3］。在龐大的甲狀腺結(jié)節(jié)人群中，甲狀腺癌不足5%。 如何有效地篩檢出甲狀腺癌患者，同時對甲狀腺癌侵襲性進(jìn)行精確分層，是當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵臨床和科學(xué)問題［3-4］。甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層的主要方法包括影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)和基因檢測。 影像學(xué)檢查中以高頻超聲最常用，細(xì)胞學(xué)檢查則多通過超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺抽吸（fine needle aspiration，F(xiàn)NA）獲取細(xì)胞以進(jìn)一步檢查，基因檢測能對細(xì)胞學(xué)不能確定的結(jié)節(jié)或不典型結(jié)節(jié)作出準(zhǔn)確診斷。 以上3 種方法互為補充，缺一不可，層層遞進(jìn)，構(gòu)成了甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層體系的基軸［1-5］。

1 甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層的“超聲-細(xì)胞-基因”體系

1.1 基于超聲影像的甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法

超聲是甲狀腺結(jié)節(jié)首選影像學(xué)檢查方法，它具有以下優(yōu)勢：實時、高分辨力、無創(chuàng)、無輻射、性價比高、操作簡便、容易普及、準(zhǔn)確性高。 超聲診斷甲狀腺結(jié)節(jié)主要基于超聲圖像上的可疑超聲特征，如實性腫物、低回聲（或顯著低回聲）結(jié)節(jié)、鈣化、形態(tài)不規(guī)則或分葉狀、縱橫比＞1、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或周圍組織浸潤等。 以上征象風(fēng)險不一，在用于判斷結(jié)節(jié)性質(zhì)時，沒有一個征象同時具有很好的靈敏度和特異度。一項meta 分析納入31 個研究18 288 個甲狀腺結(jié)節(jié)，發(fā)現(xiàn)上述征象的靈敏度為26%～87%，特異度為40%～93%［6］。由此帶來一個問題，即不同年資或不同醫(yī)院的醫(yī)師診斷水平千差萬別，讓廣大患者及臨床醫(yī)師無所適從。

在此背景下，多種基于超聲影像的甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法應(yīng)運而生，包括2015 年美國甲狀腺學(xué)會（American Thyroid Association，ATA）發(fā)布的甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層系統(tǒng)，2016 年美國臨床內(nèi)分泌醫(yī)師學(xué)會（American Association of Clinical Endocrinologists，AACE）、 美 國 內(nèi) 分 泌 學(xué) 院 （American College of Endocrinology，ACE）和意大利臨床內(nèi)分泌協(xié)會（Associazione Medici Endocrinologia，AME）聯(lián)合發(fā)布的AACE/ACE-AME 危險分層系統(tǒng)，以及2017 年美國放射學(xué)院（American College of Radiology，ACR）發(fā)布的甲狀腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）［4，7-8］。 這些甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法標(biāo)準(zhǔn)化了甲狀腺超聲術(shù)語，簡化了醫(yī)師與患者、醫(yī)師與醫(yī)師間的交流，還使甲狀腺癌風(fēng)險程度及應(yīng)采取的措施一目了然，在不同醫(yī)院之間也可通過應(yīng)用相同的系統(tǒng)構(gòu)建共同的溝通基礎(chǔ)，因而在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。

超聲甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法顯著提高了診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的靈敏度，但特異度普遍較低；此外，目前并無全球統(tǒng)一的危險分層方法，也給實際應(yīng)用及交流帶來了不便。

1.2 超聲引導(dǎo)FNA 細(xì)胞學(xué)檢查

當(dāng)具備臨床適應(yīng)證時，F(xiàn)NA 細(xì)胞學(xué)檢查被各種甲狀腺臨床診療指南公認(rèn)為最準(zhǔn)確和性價比最高的檢查方法。 FNA 靈敏度高（88.2%～97.0%），特異度較超聲檢查有所提高，但波動范圍較大（47.0%～98.2%）。 FNA 細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果多采用統(tǒng)一的Bethesda 分 類 系 統(tǒng) （Bethesda system for reporting thyroid cytopathology，BSRTC），具體如下：Ⅰ類，不能診斷；Ⅱ類，良性；Ⅲ類，意義不明的不典型或濾泡性病變（atypiao fundetermined significance/follicular lesionofunde termined significance，AUS/FLUS）；Ⅳ類，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類，可疑惡性；Ⅵ類，惡性［4］。 根據(jù)不同中心的經(jīng)驗，Ⅰ類結(jié)節(jié)發(fā)生率為20%～25%，其中有20%～30%容易惡變；Ⅲ類結(jié)節(jié)有5%～30%惡變率；Ⅳ類結(jié)節(jié)FNA 無法作出準(zhǔn)確診斷；Ⅴ類結(jié)節(jié)中仍有部分為良性。 Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ類結(jié)節(jié)又統(tǒng)稱為不確定（indeterminate）結(jié)節(jié)，發(fā)生率可高達(dá) 30%［4］。

因此，F(xiàn)NA 盡管有諸多優(yōu)點，甚至被列為甲狀腺結(jié)節(jié)首選檢查方法，但仍存在特異性變化范圍大、部分結(jié)節(jié)不能診斷、細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定等問題。FNA 結(jié)果也因為不同中心、不同操作者的穿刺標(biāo)本取材結(jié)果、不同經(jīng)驗的病理醫(yī)師而有所不同，加強規(guī)范化培訓(xùn)、 制定統(tǒng)一的指南可部分解決此類問題。 此外，基因檢測在此基礎(chǔ)上能提供更精準(zhǔn)的解決方案。

1.3 FNA 聯(lián)合基因檢測

對FNA 抽吸到的細(xì)胞同時做基因檢測，可以進(jìn)一步提高診斷特異度和準(zhǔn)確度，發(fā)現(xiàn)更多良性結(jié)節(jié)，從而減少不必要的手術(shù)。 目前研究較多的基因有 BRAF、RAS 基因突變以及 PET/PTC 基因重排等，其中 BRAF 基因突變在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中最常見，根據(jù)人種和檢測方法不同，陽性率變化范圍在29%～83%［4］。根據(jù)同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科暨上海市甲狀腺疾病研究中心的一組資料，F(xiàn)NA 聯(lián)合應(yīng)用BRAFV600E基因檢測后，診斷PTC 的靈敏度由75.7%升高至92.3%，準(zhǔn)確度由78.7%提高至90.6%。BRAFV600E突變在 Bethesda 分類系統(tǒng)Ⅰ類、 Ⅱ類、Ⅲ類、Ⅳ類、Ⅴ類、Ⅵ類結(jié)節(jié)中的檢出率分別為25%、26%、46%、20%、74%、89%［9］。 在細(xì)胞學(xué)結(jié)果良性結(jié)節(jié)中，也存在BRAFV600E基因突變陽性，此時若超聲圖像可疑征象超過2 項，仍應(yīng)考慮甲狀腺切除術(shù)。BRAFV600E基因也有少數(shù)假陽性情況。BRAFV600E突變還可用于預(yù)測 PTC 患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［10-11］。 最近的研究還發(fā)現(xiàn)HRAS/NRAS/KRAS 突變陽性的甲狀腺結(jié)節(jié)中有76%為惡性，其中濾泡型PTC 最為常見。 HRAS/NRAS/KRAS 突變陽性惡性風(fēng)險分別為92%、74%、64%。

除了以上基因外，半乳糖凝集素（galectin）-3、CD44 分子、 人骨髓內(nèi)皮細(xì)胞（human bone marrow endothelial cell，HBME）-1、細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）19、 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL）等也有學(xué)者進(jìn)行了研究［12］。

最近研究發(fā)現(xiàn)在侵襲性甲狀腺癌中，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）啟動子突變發(fā)生率較高，TERT 啟動子在甲狀腺癌中較為常見的突變位點是C228T。 文獻(xiàn)報道未分化甲狀腺癌中TERT 啟動子突變率為46.3%，低分化甲狀腺癌為37.5%，PTC 為11.7%，濾泡性甲狀腺癌為13.9%。 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科暨上海市甲狀腺疾病研究中心的一組資料發(fā)現(xiàn)，PTC 中TERT 啟動子陽性率為4.8%；TERT 啟動子（+）的甲狀腺癌，直徑更大、腺外侵犯更多、易累及血管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率高［13］。

表觀遺傳學(xué)改變（包括印跡基因印跡狀態(tài)改變）出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生前，起促進(jìn)作用。 對印跡基因表達(dá)原位檢測，可在細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變前發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，提高早期診斷率。印跡檢測方法專注于新生RNA 內(nèi)含子，而不是成熟的mRNA，以顯示印跡基因的轉(zhuǎn)錄位點。 印跡基因檢測理論上能夠在細(xì)胞學(xué)和BRAF 均無法檢出時，準(zhǔn)確地檢出惡性改變，因此具有極高的靈敏度和陰性預(yù)測值。同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科暨上海市甲狀腺疾病研究中心在國內(nèi)率先開展了甲狀腺印跡基因的前瞻性研究，初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)印跡基因能顯著提升細(xì)胞學(xué)不典型結(jié)節(jié)的診斷性能，并且有望解決濾泡狀腺瘤和腺癌細(xì)胞學(xué)乃至病理學(xué)難以鑒別的世紀(jì)難題。

綜上，F(xiàn)NA 聯(lián)合基因檢測已成為甲狀腺癌個體化精準(zhǔn)診斷和治療不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

2 甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層“超聲-細(xì)胞-基因”組學(xué)時代來臨

2.1 基于超聲組學(xué)的甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法

隨著大數(shù)據(jù)和人工智能（artificial intelligence，AI）興起，影像組學(xué)（radiomics）概念于 2012 年應(yīng)運而生。 影像組學(xué)指高通量地提取大量影像信息，實現(xiàn)感興趣區(qū)分割、特征提取與模型建立，進(jìn)一步從中提取和剝離出真正起作用的關(guān)鍵信息，用于疾病的輔助診斷、分類或分級。 影像組學(xué)多基于機(jī)器學(xué)習(xí)（machine learning，ML）和深度學(xué)習(xí)（deep learning，DL）實現(xiàn)。 深度學(xué)習(xí)能夠大幅提高分類或預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，但數(shù)據(jù)量需要傳統(tǒng)影像組學(xué)的10 倍或百倍以上。 近年來機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)有融合發(fā)展的趨勢，將深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)輸出的特征與影像組學(xué)中的經(jīng)典分類器結(jié)合，能在有限的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集上，進(jìn)一步提升影像組學(xué)分類或預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性［14-15］。

超聲組學(xué)（ultrasomics）是影像組學(xué)的一個重要分支。針對前述超聲影像甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法的局限性，部分學(xué)者采用超聲組學(xué)做了一些有益的探索。 Ma 等［16］采用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（convolutional neural network，CNN）分析了 15 000 幅超聲圖像，報道深度學(xué)習(xí)鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的準(zhǔn)確度約為83.0%。Li 等［17］采用另一種 CNN 模型，靈敏度為 93.5%，特異度為 81.5%。 Akkus 等［14］的一組資料發(fā)現(xiàn) CNN 診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度為 86%、特異度為90%。 中山大學(xué)和同濟(jì)大學(xué)團(tuán)隊對1 040 個病例3 120 幅圖像進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超聲組學(xué)和深度學(xué)習(xí)的準(zhǔn)確性分別為66.8%和74.7%，深度學(xué)習(xí)方法具有更高的診斷效能［18］。Akkus 等［14］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)深度學(xué)習(xí)的靈敏度設(shè)置到最高值時，可以減少52%不必要FNA，同時不會漏診惡性甲狀腺結(jié)節(jié)，證實深度學(xué)習(xí)的應(yīng)用有望改變甲狀腺結(jié)節(jié)的診療流程。

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科暨上海市甲狀腺疾病研究中心趙崇克等建立了一種機(jī)器學(xué)習(xí)與視覺融合的超聲組學(xué)方法，證實比傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法和TI-RADS 具有更高的診斷效能（AUC：0.900～0.917 vs.0.770～0.789 vs.0.681～0.689）；同時發(fā)現(xiàn)在引入剪切波彈性成像后，機(jī)器學(xué)習(xí)與視覺融合超聲組學(xué)方法的診斷效能可得到進(jìn)一步提升（AUC：0.951～0.953 vs. 0.900～0.917），證實基于雙模態(tài)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法在結(jié)節(jié)危險分層上具有重要價值，并且與TI-RADS 比較能顯著降低不必要的FNA（30.0%～37.7% vs. 4.5%～4.7%）［19］。

超聲組學(xué)在實際應(yīng)用過程中仍存在不同超聲儀器、不同醫(yī)院、不同年資醫(yī)師之間圖像不一致問題，需要進(jìn)一步統(tǒng)一儀器條件、統(tǒng)一圖像標(biāo)準(zhǔn)、加強醫(yī)師培訓(xùn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的圖像。 此外，需要進(jìn)一步完善和標(biāo)準(zhǔn)化影像組學(xué)方法，尤其是在目前統(tǒng)一算法和流程尚不成熟的條件下。

2.2 基于基因組學(xué)的甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層方法

由于甲狀腺腫瘤的基因異常靶點眾多，人群中存在一定異質(zhì)性，因此多分子聯(lián)合檢測應(yīng)運而生，以提高診斷的靈敏度和特異度。 近年來，Afirma 基因表達(dá)分類（gene expression classifier，GEC）方法廣泛用于診斷不確定細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的結(jié)節(jié)，該檢測方法包括167 個差異表達(dá)基因。 有研究對49 個研究中心265 個無法判斷細(xì)胞性質(zhì)的結(jié)節(jié)進(jìn)行前瞻性研究，證實GEC 對不典型增生的陰性預(yù)測值達(dá)到95%，濾泡狀腺瘤達(dá)到 94%［3］。 Afirma GEC 可使 1/3不確定結(jié)節(jié)免于不必要手術(shù)［20］。

盡管Afirma GEC 方法被眾多權(quán)威團(tuán)隊和指南推薦，但它對可疑結(jié)節(jié)的特異度和陽性預(yù)測值仍偏低。 近期，Afirma GEC 升級版Afirma 基因組測序分類（genomic sequencing classifier，GSC）引入臨床。 與GEC 比較，GSC 對不確定結(jié)節(jié)的陽性預(yù)測值有較大提升（57.1% vs. 36.7%）［21］。 其他多分子組合還包括Thyroseq V2（包括 14 個基因-點突變、42 種融合基因、8 個基因表達(dá)）、Thyroseq V3（共 112 個基因，包括點突變，插入缺失、融合基因，拷貝數(shù)變異、表達(dá)異常等）。有報道發(fā)現(xiàn)對不典型增生/濾泡狀腺瘤，術(shù)前FNA 聯(lián)合Thyroseq V2 診斷甲狀腺癌的靈敏度為 90.9%，特異度為 92.1%；另一組報道發(fā)現(xiàn)Thyroseq V3 的靈敏度為98.0%，特異度為81.8%，準(zhǔn)確度達(dá)90.9%；因此，可以應(yīng)用Thyroseq V2 和Thyroseq V3 來指導(dǎo)形成治療策略［4，12，22］。

3 結(jié)論

總體看，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的來臨，使得根據(jù)“超聲-細(xì)胞-基因” 組學(xué)特征對甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行危險分層成為可能。 針對甲狀腺結(jié)節(jié)龐大人群，早期、精確、直觀、量化、易行的診斷方法是開展甲狀腺結(jié)節(jié)危險分層所追求的目標(biāo)。 “超聲-細(xì)胞-基因”組學(xué)體系的建立和不斷完善，是實現(xiàn)這一目標(biāo)的重要途經(jīng)，同時也為各種新型診療方案的選擇提供了重要依據(jù)［23-27］。