SARS-CoV-2病原學(xué)特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)

賴媛媛， 王宇婷， 陳家倪， 齊 軍， 何振業(yè)

（1.國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518116；2.深圳市華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518000）

2019年12月，武漢地區(qū)突發(fā)一種由新型冠狀病毒引起的肺炎病例。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織將這一新發(fā)傳染病正式命名為新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），同時(shí)，國際病毒分類委員會(huì)將這一新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。SARSCoV-2傳染性極強(qiáng)，醫(yī)務(wù)人員感染率高達(dá)29%[1]?；颊叱Ｒ?guī)檢測(cè)的臨床樣本（血、痰液、糞便及尿液等）可產(chǎn)生氣溶膠，具有潛在致病性和高傳染性。為了給臨床提供快速、準(zhǔn)確的診療依據(jù)，且能避免實(shí)驗(yàn)室人員感染，本文就SARS-CoV-2的病原學(xué)特點(diǎn)、臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段及臨床實(shí)驗(yàn)室的生物安全防控措施作一綜述。

1 SARS-CoV-2病原學(xué)特點(diǎn)及流行病學(xué)特征

SARS-CoV-2是直徑為60～140 nm，且有包膜的β屬冠狀病毒，與非典型性肺炎病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)及中東呼吸綜合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV) 為同一屬[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)SARSCoV-2編碼15種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1～nsp10、nsp12～nsp16）、4種結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M和N）和8種輔助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14），且這些編碼蛋白的氨基酸序列上，與SARS-CoV之間存在差異性氨基酸位點(diǎn)，如編碼的8b蛋白（121個(gè)氨基酸）的長度要長于SARS-CoV（84個(gè)氨基酸）[3]。有學(xué)者用冷凍電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S蛋白對(duì)人體ACE2的親和力高于SARS-CoV的S蛋白[4]，提示SARS-CoV-2與SARS-CoV在致病性、傳染性和抵抗力等方面存在差異。SARS-CoV-2對(duì)紫外線和熱敏感，56℃ 30 min以及脂溶劑（75%乙醇、含氯消毒劑、氯仿等，氯己定除外）均可有效滅活病毒[5]。人類為SARS-CoV-2易感宿主，在人際間除飛沫傳播外，還存在糞-口傳播、間接接觸傳播和氣溶膠傳播等多種傳播途徑[6]，傳染性比SARS-CoV和MERS-CoV強(qiáng)[7]。COVID-19患者常出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽和乏力的癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)功能衰竭，還可能引起消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及泌尿系統(tǒng)的功能障礙[8]。

2 COVID-19實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 血液檢測(cè)

COVID-19患者白細(xì)胞總數(shù)正常或減少，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A升高[5]。中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值可用于評(píng)估COVID-19患者病情的進(jìn)展程度，準(zhǔn)確性較高，如COVID-19患者的中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值≥3.13，表明患者有較高重癥的風(fēng)險(xiǎn)[9]。有研究結(jié)果顯示，COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量雖然都有明顯減少，但狀態(tài)均表現(xiàn)為過度活化，且CD8+T細(xì)胞有高毒性[10]。這是COVID-19患者免疫系統(tǒng)損傷的重要原因。

2.2 生化和免疫檢測(cè)

COVID-19患者會(huì)出現(xiàn)肌酸激酶、乳酸脫氫酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶以及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高[5]，還會(huì)出現(xiàn)血清白蛋白水平降低、血漿血管緊張素Ⅱ水平升高，部分患者還出現(xiàn)尿蛋白水平升高[11-12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者血漿中細(xì)胞因子（粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等）水平明顯升高[13]，表明SARS-CoV-2感染會(huì)引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。

2.3 凝血功能檢測(cè)

有研究結(jié)果表明，COVID-19患者纖維蛋白原以及D-二聚體會(huì)升高；當(dāng)COVID-19患者出現(xiàn)早期的彌散性血管內(nèi)凝血時(shí)，D-二聚體可顯著升高，伴有凝血酶原時(shí)間的輕度延長；當(dāng)COVID-19患者出現(xiàn)顯性的彌散性血管內(nèi)凝血時(shí)，血小板計(jì)數(shù)會(huì)顯著減少；COVID-19死亡病例中，患者血漿中的纖維蛋白降解產(chǎn)物也顯著升高[13]。

2.4 病原學(xué)檢查

2.4.1 SARS-CoV-2的核酸檢測(cè) 目前，主要采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)患者標(biāo)本（鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及糞便等）中是否含有SARS-CoV-2特異性的RNA序列，來對(duì)COVID-19進(jìn)行早期病原學(xué)診斷[14]。但這一檢測(cè)方法存在一定的假陰性，原因在于：（1）臨床樣本采集的部位與方法不同，導(dǎo)致SARS-CoV-2的載量過少，無法檢測(cè)；（2）診斷試劑的可靠性及敏感性有限。為此，在檢測(cè)之前，應(yīng)做到以下2點(diǎn)：（1）對(duì)臨床樣本的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，保證采集的臨床樣本病毒載量能在檢測(cè)范圍內(nèi)；（2）驗(yàn)證試劑的性能，保證結(jié)果的精密度和符合性。

此外，目前還有納米孔靶向測(cè)序（nanopore targeted sequencing，NTS）方法。該方法主要檢測(cè)SARS-CoV-2的10 kb基因區(qū)域，增加捕獲SARS-CoV-2核酸的概率，且可讀出其基因序列，敏感性和準(zhǔn)確性高于RT-qPCR。NTS可實(shí)現(xiàn)在4 h內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)SARS-CoV-2，且可檢測(cè)SARSCoV-2基因組變異情況[15]。

2.4.2 SARS-CoV-2的特異性抗體檢測(cè) 血清中的SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測(cè)可用于篩查和輔助診斷COVID-19。IgM是COVID-19患者體內(nèi)早期（發(fā)病3～5 d）出現(xiàn)的抗體，而IgG則是感染中、后期產(chǎn)生的抗體[5]，對(duì)COVID-19患者進(jìn)行血清特異性IgM和IgG抗體檢測(cè)，不僅可用于早期疑似病例篩查，還可以用于COVID-19患者的病程監(jiān)測(cè)和回顧性診斷。特異性抗體檢測(cè)也有其局限性，主要為：（1）產(chǎn)生抗體前存在窗口期；（2）抗體檢測(cè)易受干擾，如患者血液中存在類風(fēng)濕因子、非特異IgM或自身抗體等，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

3 實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)

3.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境生物安全防護(hù)

3.1.1 實(shí)驗(yàn)室分區(qū) 實(shí)驗(yàn)室須合理劃分清潔區(qū)、緩沖區(qū)和污染區(qū)，避免交叉污染。須在生物安全二級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行COVID-19患者的常規(guī)血液檢測(cè)、體液檢測(cè)以及SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)[6]。應(yīng)注意的是：（1）血常規(guī)和C反應(yīng)蛋白等檢測(cè)建議采用閉管操作，病毒抗原或抗體篩查等開放性操作應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；（2）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境須符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室基本要求，并獲得有關(guān)部門批準(zhǔn)后方可開展SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)工作；（3）若負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)正壓時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)緊急撤離。

3.1.2 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境消毒 臨床實(shí)驗(yàn)室需采用以下的消毒措施[16]：（1）實(shí)驗(yàn)室每天都要進(jìn)行紫外線照射進(jìn)行空氣消毒，照射時(shí)間不短于30 min；（2）實(shí)驗(yàn)室每天需在試驗(yàn)前后使用1 000 mg/L有效氯消毒液對(duì)工作臺(tái)面及地面進(jìn)行消毒；（3）生物安全柜等金屬設(shè)備和儀器采用75%乙醇進(jìn)行消毒。

3.1.3 實(shí)驗(yàn)室生物安全操作失誤或意外的防護(hù)處理 當(dāng)臨床樣本出現(xiàn)溢灑時(shí)，應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室空間密閉，防止污染物擴(kuò)散；采用5 500 mg/L有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區(qū)30 min后進(jìn)行擦拭消毒[17]，消毒液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，有效期為1 d。

3.2 實(shí)驗(yàn)室人員生物安全防護(hù)

需要接觸SARS-CoV-2標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)實(shí)施生物二級(jí)以上的個(gè)人防護(hù)[16]。

實(shí)驗(yàn)室人員防護(hù)用品穿戴順序?yàn)椋涸诜前l(fā)熱門診等常規(guī)檢驗(yàn)區(qū)域執(zhí)行手衛(wèi)生，戴帽子、醫(yī)用外科口罩/醫(yī)用防護(hù)口罩和手套；在發(fā)熱門診實(shí)驗(yàn)室和PCR實(shí)驗(yàn)室等進(jìn)行SARS-CoV-2檢驗(yàn)的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域需戴護(hù)目鏡/防護(hù)面罩（屏），穿隔離衣和穿防護(hù)鞋套（靴），戴橡膠手套。

實(shí)驗(yàn)室人員防護(hù)用品脫順序?yàn)椋涸谖廴緟^(qū)脫手套、脫隔離衣、脫防護(hù)鞋套（靴）、脫防護(hù)面罩/護(hù)目鏡。注意事項(xiàng)：（1）執(zhí)行每一步動(dòng)作后需執(zhí)行手衛(wèi)生；（2）脫防護(hù)服前，可用500 mg/L有效氯消毒劑進(jìn)行全身噴霧消毒；（3）防護(hù)面罩與護(hù)目鏡須75%乙醇浸泡消毒后方可重復(fù)使用。在緩沖區(qū)脫口罩、帽子后執(zhí)行手衛(wèi)生，方可進(jìn)入清潔區(qū)。

3.3 臨床樣本處理

3.3.1 檢驗(yàn)前的樣本處理 檢驗(yàn)前對(duì)臨床樣本的處理需采用以下防護(hù)措施[18-19]：（1）標(biāo)本采集。采集者須按照三級(jí)生物安全防護(hù)，且在采集過程中要做到盡量減少接觸患者皮膚、衣服、用品等；避開患者咳嗽的時(shí)刻，避免飛沫傳播；盡量縮短在床旁的持續(xù)時(shí)間。（2）樣本轉(zhuǎn)運(yùn)。COVID-19患者的臨床樣本需專人運(yùn)輸，運(yùn)輸者須采用二級(jí)生物安全防護(hù)，需采用具有3層包裝的專用運(yùn)輸系統(tǒng)，包括SARS-CoV-2專用轉(zhuǎn)運(yùn)箱、樣本盒和有生物安全標(biāo)識(shí)的密封袋，標(biāo)本采集后，將臨床樣本裝入密封袋，置于樣本盒中，再放入轉(zhuǎn)運(yùn)箱。運(yùn)輸時(shí)間不超過2 h。運(yùn)輸期間保持轉(zhuǎn)運(yùn)箱平穩(wěn)。若運(yùn)輸發(fā)生意外，須到接收地點(diǎn)與接收者共同處理。（3）樣本接收與處理。接收、分揀、離心疑似或確診患者臨床樣本時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員須采用二級(jí)生物安全防護(hù)。交接環(huán)節(jié)需有記錄，以便溯源。開啟轉(zhuǎn)運(yùn)箱取樣本前，應(yīng)使用75%乙醇噴霧消毒轉(zhuǎn)運(yùn)箱；從密封袋取出樣本后，應(yīng)用紫外燈或75%乙醇對(duì)樣本及轉(zhuǎn)運(yùn)箱、樣本盒進(jìn)行消毒。樣本離心后靜置10 min方可取出。若離心時(shí)臨床樣本出現(xiàn)灑漏時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員須按照三級(jí)生物安全防護(hù)，需立即停止離心，靜置30 min以上后進(jìn)行75%乙醇噴霧消毒處理方可取出標(biāo)本，并使用75%乙醇擦拭（噴淋）消毒離心機(jī)。

3.3.2 檢驗(yàn)中的樣本處理 檢驗(yàn)中對(duì)臨床樣本的處理需采用以下防護(hù)措施[6，19]：（1）血常規(guī)由閉管的全自動(dòng)儀器檢測(cè)，執(zhí)行此操作的實(shí)驗(yàn)室人員須采用二級(jí)生物安全防護(hù)。若需涂片鏡檢，實(shí)驗(yàn)室人員須按照三級(jí)生物安全防護(hù)在生物安全柜內(nèi)操作，涂片完成后須紫外照射30 min后再取出閱片。閱片完成后，應(yīng)將玻片置于5 500 mg/L含氯消毒液的銳器盒中。（2）生化、免疫與凝血功能檢測(cè)需開蓋檢測(cè)。應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成開蓋后，用專用箱運(yùn)輸至全自動(dòng)儀器檢測(cè)。執(zhí)行此操作的實(shí)驗(yàn)室人員須采用三級(jí)生物安全防護(hù)。生物安全柜操作前后需開啟風(fēng)機(jī)運(yùn)行5 min。（3）SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)：樣本進(jìn)行核酸擴(kuò)增前需對(duì)臨床樣本進(jìn)行病毒滅活（56℃孵育30 min后加入蛋白酶K或試劑盒自帶的核酸提取裂解液）。執(zhí)行此操作的實(shí)驗(yàn)室人員須采用三級(jí)生物安全防護(hù)。

3.3.3 檢驗(yàn)后樣本處理 檢驗(yàn)后對(duì)臨床樣本的處理需采用以下防護(hù)措施[6]：（1）檢驗(yàn)報(bào)告建議無紙化，若需要紙質(zhì)報(bào)告，須有效消毒才出檢驗(yàn)科。（2）開蓋的臨床樣本檢測(cè)完后須在生物安全柜中重新蓋上新的管帽密封，置于有生物危害標(biāo)識(shí)的雙層醫(yī)用垃圾包裝袋（黃色）中密封放置。（3）所有的臨床標(biāo)本，包括密閉試管和開蓋的試劑盒，均需要采用高壓滅菌。

4 廢棄物處理

4.1 廢液的處理

對(duì)于檢驗(yàn)過程中產(chǎn)生的感染性廢液，需用10 000 mg/L有效氯消毒劑進(jìn)行消毒處理，且需驗(yàn)證消毒效果，確保感染源被徹底滅活[20]。

4.2 固體廢物的處理

對(duì)于實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的固體廢物（如檢驗(yàn)后的臨床樣本、耗材和個(gè)人防護(hù)裝備等）須使用雙層標(biāo)注“新型冠狀病毒感染的肺炎”的包裝袋包裝，采用鵝頸結(jié)式分層封口，經(jīng)高壓滅菌后，集中將其通過廢棄物通道送至固體醫(yī)療廢棄處理單位處置[21]。

4.3 建立廢棄物處理記錄

定期監(jiān)測(cè)處理后的污水及壓力蒸汽滅菌效果，并如實(shí)填寫所有“新型冠狀病毒感染的肺炎”標(biāo)本的處理記錄，且此資料保存3年[21]。

5 總結(jié)

及時(shí)發(fā)現(xiàn)、早期診斷和快速干預(yù)對(duì)于挽救COVID-19患者的生命至關(guān)重要?？焖?、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以為COVID-19的診療提供重要的依據(jù)。目前臨床上用于COVID-19患者診斷的重要的實(shí)驗(yàn)室檢查有血液檢測(cè)、生化及免疫檢測(cè)和病原學(xué)檢查。其中病原學(xué)檢查，包括SARSCoV-2特異性抗體和核酸檢測(cè)為COVID-19確診提供了病原學(xué)依據(jù)。由于這些臨床樣本具有潛在的致病性和傳染性，故實(shí)驗(yàn)室人員在檢驗(yàn)操作的全過程中，應(yīng)采用必要的實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)措施，避免在檢驗(yàn)過程中交叉感染，而且要防止臨床樣本中可能含有的病原體對(duì)外界環(huán)境的污染。