牙髓干細(xì)胞在組織工程及再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展*

王付燕 杜立群

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)院眼科，濟(jì)南 250012）

理想的種子細(xì)胞是組織工程領(lǐng)域研究的重點，必須具有來源豐富、易于分離培養(yǎng)、體外培養(yǎng)及重建過程具有較強(qiáng)的增殖能力并長期維持生理功能及生物活性、能控制分化方向及應(yīng)用安全等特點。2000年，Gronthos等[1]利用消化酶法將人類健康第3磨牙牙髓制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過培養(yǎng)得到能夠形成細(xì)胞克隆和具有高度增殖能力的細(xì)胞，并將其命名為牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。DPSCs取自牙髓組織，具有良好的生物學(xué)特性，如高度增殖、自我更新能力和多向分化潛能，自體移植能最大限度降低免疫排斥反應(yīng)和交叉感染風(fēng)險，來源豐富，取材簡便，不對人體造成二次傷害且不涉及倫理問題。近年來，DPSC在組織工程及再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用日益受到研究者關(guān)注，現(xiàn)對其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DPSCs的生物學(xué)特性

1.1 多向分化、高度增殖潛能

DPSCs來源于胚胎時期神經(jīng)嵴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenehymal stem cells，BMMSCs）[2-3]，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）的表面標(biāo)記SH2、SH3、SH4和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的表面標(biāo)記OCT 4、NANOG、SSEA-3和SSEA-4。體外培養(yǎng)具有向三胚層（內(nèi)、中、外）細(xì)胞分化的能力[4-5]。研究顯示，體外培養(yǎng)的DPSCs呈梭形，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可分化成為破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等[6]。雖然DPSCs和BMMSCs均可向骨、軟骨、肌肉、脂肪和神經(jīng)方向分化，然而DPSCs卻表現(xiàn)出更高的分化能力，其增殖速度是BMMSCs的30～50倍[7-8]，提示DPSCs將為組織修復(fù)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的發(fā)展方向。

1.2 免疫調(diào)節(jié)能力

DPSCs和BMMSCs均具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力。研究表明[9]，DPSCs具有誘導(dǎo)活化T細(xì)胞凋亡、減輕免疫相關(guān)組織損傷的能力。FasL（Fas ligand，F(xiàn)asL）是一種跨膜蛋白，在Fas凋亡通路中發(fā)揮重要作用。利用siRNA技術(shù)敲除DPSCs中FasL能降低其誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的能力，并能降低其抗炎療效，說明DPSCs免疫調(diào)節(jié)能力由FasL調(diào)控。然而，F(xiàn)asL表達(dá)水平并不影響DPSCs的增殖速率和多向分化能力。動物實驗表明[10]DPSCs具有顯著抑制輔助性Th17細(xì)胞（T helper 17，Th17）的作用，移植DPSCs后能夠逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）相關(guān)功能障礙。Ding等[11]研究顯示，DPSCs通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抑制淋巴細(xì)胞增殖。將DPSCs移植到缺血缺氧小鼠模型中，能產(chǎn)生抗炎反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)[12]。He等[13]報道脂多糖能夠刺激DPSCs高表達(dá)白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8），IL-8是趨化因子家族的細(xì)胞因子，對中性粒細(xì)胞有趨化能力，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如果DPSCs誘導(dǎo)分化后仍然具有與未分化時相似的免疫調(diào)節(jié)能力，可以通過調(diào)節(jié)免疫特性成為治療免疫疾病的干細(xì)胞資源。

1.3 旁分泌作用

體內(nèi)實驗顯示，DPSC能通過旁分泌形式分泌-系列細(xì)胞因子[14-20]，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（chemokine stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、腦源性神經(jīng)生長因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、睫狀神經(jīng)生長因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulation factor，G-CSF）和干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF），這些細(xì)胞因子具有促進(jìn)新生血管生成、抗凋亡及保護(hù)再生組織的作用。Song等[21]研究顯示，DPSCs在缺血性動物模型中對星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)越的細(xì)胞保護(hù)作用。將DPSCs植入局灶腦缺血后24 h內(nèi)嚙齒類動物模型的大腦中，4周時可見動物神經(jīng)學(xué)行為得到極大改善，而且對側(cè)前肢的感覺運(yùn)動功能明顯提高，雖然此時植入的DPSCs僅有約2.3%的存活率，但是這些細(xì)胞能定向遷移到大腦缺血區(qū)域，并分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，研究者提出這種功能的改善不是神經(jīng)的替換而更多的是依賴于DPSCs的旁分泌作用[22]。DPSCs還能誘導(dǎo)小鼠動物模型后肢局部缺血處功能性新生血管形成[23]。

2 DPSCs在組織工程及再生醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 在牙修復(fù)重建中的應(yīng)用

齲齒和牙髓炎嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前主要采用根管治療，即清除髓腔內(nèi)的牙髓組織并應(yīng)用合成材料填充髓腔，治療后的牙齒脆弱、易于骨折并有再次感染可能。Asghari等[24]將DPSCs放在含有地塞米松（dexamethasone，DXM）、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉以及骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，顯示新生的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞以及大量的鈣結(jié)節(jié)和膠原沉積形成，并表達(dá)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein，DSPP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein，DMP-1）等成分。周慧等[25]提出，轉(zhuǎn)化生長因子β3與肝素聯(lián)合作用可誘導(dǎo)人類乳牙牙髓干細(xì)胞（human immature dental pulp stem cells，HIDPSCs）分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、ALP活性增強(qiáng)、DSPP表達(dá)增加。Tran等[26]將DPSCs與人類牙本質(zhì)共培養(yǎng)并移植到小鼠模型中，顯示牙本質(zhì)樣組織形成。張紅梅等[27]研究表明，小腸黏膜下層浸提液能明顯刺激體外培養(yǎng)的DPSCs增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞礦化并能提高細(xì)胞ALP水平，誘導(dǎo)后的DPSCs表達(dá)DSPP和DMP-1。DPSCs在體外構(gòu)建組織工程牙將逐漸成為可能，這對于提高缺牙患者的生活質(zhì)量具有遠(yuǎn)大意義。

2.2 在骨修復(fù)重建中的應(yīng)用

骨基質(zhì)具有獨(dú)特的礦化能力，尋找理想的種子細(xì)胞是骨組織工程研究的熱點。由于成骨細(xì)胞起源于BMMSCs，而DPSCs又是BMMSCs的一種，因此Kermani等[28]將DPSCs在含有抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、MEM的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)后，顯示DPSCs可以向成骨細(xì)胞分化，并表達(dá)成骨標(biāo)志物：ALP、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和OCN，另外DPSCs還具有骨特有的礦化能力[29]，能形成鈣鹽沉積和礦化結(jié)節(jié)，是骨再生修復(fù)中成骨細(xì)胞的潛在干細(xì)胞來源。文軍等[30]研究顯示，改良富血小板血漿對HIDPSCs的增殖和成骨分化具有一定的促進(jìn)作用，且體積分?jǐn)?shù)為2%的改良富血小板血漿促增殖能力最強(qiáng)，堿性磷酸酶活性達(dá)到最高。這就表明適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)的富血小板血漿可以顯著促進(jìn)DPSCs的成骨分化能力。Chamieh等[31]將DPSCs與蠶絲蛋白支架共同培養(yǎng)，DPSCs表現(xiàn)出較高的礦化能力，能夠分化為骨組織，并能表達(dá)OCN和膠原蛋白。Wolosz等[32]通過DPSCs與膠原蛋白凝膠支架結(jié)合促進(jìn)大鼠顱面骨的愈合，顯示再生骨骨密度、纖維結(jié)締組織以及礦化骨組織的體積明顯增加。早在2009年，DPSCs在骨組織缺損修復(fù)領(lǐng)域已進(jìn)入臨床研究階段[33]，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍然存在很多問題，有待進(jìn)一步探索研究。

2.3 在神經(jīng)修復(fù)重建中的應(yīng)用

脊髓損傷后，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，殘余的軸突難以再生從而導(dǎo)致持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。DPSCs是神經(jīng)嵴來源的干細(xì)胞，具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，其研究為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟了新思路。方成志等[34]應(yīng)用含氫化可的松、二甲基亞砜、丁羥基茴香醚、forskolin、β-巰基乙醇的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)DPSCs，能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并能表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異型標(biāo)志巢蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白。研究表明，移植HIDPSCs對脊髓損傷具有顯著的治療效果，其促進(jìn)神經(jīng)再生的主要機(jī)制為：（1）抑制早期炎癥反應(yīng)；（2）抑制脊髓損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，保護(hù)神經(jīng)纖維和髓鞘；（3）通過旁分泌的形式直接抑制軸突生長抑制因子（髓鞘相關(guān)糖蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖）的釋放；（4）在脊髓損傷部位，DPSCs分化為成熟的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)軸突的生長，這表明HDPSCs在神經(jīng)損傷再生治療中的應(yīng)用潛力，有望成為修復(fù)脊髓損傷一種安全有效又可靠的臨床治療手段[35-36]。最近研究[37]報道含混合生長因子音猬因子（sonic hedgehog，SHH）、纖維母細(xì)胞生長因子8（fibroblast growth factor 8，F(xiàn)GF-8）、GDNF和毛喉素（forskolin）的培養(yǎng)基能誘導(dǎo)人SHEDs分化成包含DA能神經(jīng)元的細(xì)胞群。

2.4 在肌肉修復(fù)重建中的應(yīng)用

杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（DMD）是由于缺乏功能性結(jié)構(gòu)蛋白肌，導(dǎo)致嚴(yán)重的肌肉萎縮癥、行動不便，患者通常在20歲左右時就會因為心肌、肺肌無力而死亡。Chen等[38]研究顯示，抑制miR-143的表達(dá)能顯著增強(qiáng)肌分化因子和快肌凝蛋白重鏈基因的表達(dá)，并提出miRNA 參與調(diào)節(jié)脊椎動物不同肌肉類型功能的表達(dá)。Li等[39]用5-氮雜-2'-脫氧胞苷處理DPSCs，miR-135和miR-143表達(dá)明顯受到抑制，DPSCs表現(xiàn)出顯著的成肌特性并有肌小管形成，由此得出miRNAs 在誘導(dǎo)DPSCs肌源性分化的過程中起到?jīng)Q定性作用。另有研究者[40]報道，DPSCs能夠從減小纖維化和促進(jìn)血管生成兩個方面來改善DMD小鼠模型營養(yǎng)不良骨骼肌組織的病理狀態(tài)，這些結(jié)果為進(jìn)一步研究將DPSCs更有效用于肌肉修復(fù)再生的機(jī)制鋪平了道路。

肌肉萎縮癥是X連鎖隱形遺傳病，平均每3 500個男性新生兒中就有1個肌肉萎縮癥患兒。曾有研究者[41]提出DPSCs可表達(dá)特異性的成肌細(xì)胞表面標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin），在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可開啟成肌特異性基因并分化為肌源性細(xì)胞，將DPSCs與鼠肌C2C12細(xì)胞在嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)可觀察到肌管融合現(xiàn)象[42]。此后有研究者將DPSCs注射到患肌肉萎縮癥的金毛獵犬體內(nèi)，免疫熒光檢測顯示肌纖維形成，肌萎縮癥狀明顯改善[43]。急性心肌梗死裸鼠心肌注射DPSCs 4周，梗死區(qū)大量新生血管生成、梗死面積明顯減小，左心室功能顯著提高[44]，提示DPSCs是治療肌肉萎縮和急性心肌梗死潛在的干細(xì)胞來源。

2.5 在角膜修復(fù)重建中的應(yīng)用

角膜盲是嚴(yán)重的致盲性眼病，目前主要治療方法是同種異體角膜移植，供體來源匱乏及免疫排斥反應(yīng)等限制了其臨床應(yīng)用。組織工程角膜構(gòu)建是目前眼科界研究的熱點，理想的種子細(xì)胞是其中的關(guān)鍵要素。Monteiro等[45]報道DPSCs體外可持續(xù)表達(dá)角膜緣干細(xì)胞（1imbal stem cell，LSC）特異性標(biāo)記物，隨后該團(tuán)隊又將組織工程人未成熟DPSCs植片直接放置在堿燒傷兔角膜暴露的透明角膜基質(zhì)上，1～12周實驗動物角膜透明度逐漸改善，組織學(xué)分析顯示角膜燒傷處有形態(tài)良好的基質(zhì)層結(jié)構(gòu)和復(fù)層上皮形成，證明接種人未成熟DPSCs能夠促進(jìn)堿燒傷動物角膜形成功能性的角膜上皮組織[46]。Kushnerev等[47]以角膜接觸鏡為載體成功地將DPSCs移植到角膜表面，并檢測到角膜上皮標(biāo)記物CK3、CK12等的表達(dá)，再次證實了DPSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的潛能。并且相關(guān)研究[48]提出DPSCs能夠促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞生長及角膜上皮再生，并具有阻止角膜結(jié)膜化，維持角膜透明的能力。Syedpicard等[49-50]報道DPSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)后具有分化為角膜基質(zhì)細(xì)胞、角膜蛋白和硫酸角質(zhì)素的能力，說明DPSCs具有分化為角膜基質(zhì)細(xì)胞的潛能。這些研究證明，DPSCs在角膜再生組織工程研究中具有潛在的臨床應(yīng)用價值，但是未來還需要進(jìn)一步的研究探索DPSCs促進(jìn)受損角膜再生的機(jī)制。

2.6 其他

隨著組織工程學(xué)及交叉學(xué)科的融合發(fā)展，DPSCs在組織工程及再生醫(yī)學(xué)研究的應(yīng)用領(lǐng)域也逐漸拓展。Han等[51]提出DPSCs能夠分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞并具有儲存糖原和生產(chǎn)尿素的功能，為肝病提供了有前景的治療方法。相關(guān)研究[52]提出DPSCs能分化為胰島素生成細(xì)胞，有望為糖尿病的治療開辟另一條嶄新的途徑。

3 問題和展望

DPSCs多取材于自然替換的乳牙、第3磨牙、正畸牙或其他原因需要拔除的牙，是自體移植中容易獲取的種子細(xì)胞來源，具有作為組織工程種子細(xì)胞的諸多優(yōu)勢，呈現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景。盡管對DPSCs的研究應(yīng)用已取得很多的突破，但是主要局限在動物模型上，要想將其成功用于臨床組織再生，還存在著諸多問題，如DPSCs的特異性表面標(biāo)記物至今仍不明確；牙髓組織中難以確切定位；分化調(diào)控機(jī)制尚不清楚；體外培養(yǎng)周期長，難以大量擴(kuò)增以及分化的哪個時期最適合移植等。

但是相信隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，生命科學(xué)、工程學(xué)及材料學(xué)等相關(guān)學(xué)科交叉發(fā)展，以及科研工作者的不懈努力，這些問題將會得到更加深入的探討和逐步解決。DPSCs的研究將日趨完善，并實現(xiàn)真正意義上的組織再生。