加減薯蕷丸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子EB介導(dǎo)的自噬溶酶體通路改善APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力研究

邱 靜，鄢文靜，張雨婷，譚子虎，楊 瓊

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是與年齡相關(guān)的癡呆癥中最常見的類型，可導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆的認(rèn)知衰退和大量神經(jīng)變性[1]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還缺乏明確有效的防治藥物。中醫(yī)藥在辨證論治、整體觀念指導(dǎo)下，針對(duì)AD等復(fù)雜疾病具有一定的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為AD的病機(jī)特點(diǎn)為脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)。本課題組根據(jù)AD病機(jī)特點(diǎn)組方加減薯蕷丸，在前期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)加減薯蕷丸可以提高輕、中度AD患者簡(jiǎn)易智能狀態(tài)量表評(píng)分，改善日常生活能力，同時(shí)可以降低中醫(yī)證候積分[2]。但加減薯蕷丸在改善AD癥狀中的作用機(jī)制尚未明了，因此本研究應(yīng)用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究加減薯蕷丸具體作用效應(yīng)及其可能機(jī)制，為藥物臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)5月齡健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(B6C3-TgAPPswe/PS1de9)20只，購于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0008，體質(zhì)量(33.7±3.2)g。飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2017-0095]。溫度(21±3)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，自由攝食攝水，12 h明暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加減薯蕷丸濃縮劑(又名薯蕷健脾益智合劑，由湖北省中醫(yī)院制劑中心制備，批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20150027，批號(hào) 20190101)，組方：山藥30 g，制何首烏、熟地黃各24 g，黨參、白芍、當(dāng)歸各20 g、麩炒白術(shù)、茯苓、枸杞子各18 g，石菖蒲14 g，杜仲、遠(yuǎn)志各12 g，川芎、五味子各10 g。上14味中藥，加水煎煮3次，每次1 h，過濾后合并濾液，經(jīng)物理方法濃縮提純而成口服液250 mL，生藥含量1 g/mL，真空包裝，4 ℃冷藏備用。

1.3 主要試劑 RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購于碧云天，ECL底物液購于Thermo；二抗購于武漢博士德，微管相關(guān)蛋白3(microtubule-associated light chain3，LC3)B(14/16 kD)、組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)、溶酶體膜相關(guān)蛋白1(lysosomal-associated membrane proteins 1，LAMP1)、P62購于CST；β淀粉樣蛋白42(amyloid-β42，Aβ42)試劑盒購于elabscience；Nonidet P40試劑盒、轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)抗體購于美國(guó)Santa。

1.4 主要儀器 Morris水迷宮：成都泰盟科技有限公司；mulISKANMK3型酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；HI650型離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；微量移液器：Eppendorf；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；垂直電泳槽：北京六一儀器廠。

2 方法

2.1 分組及干預(yù)方法 20只APP/PS1小鼠，隨機(jī)分為模型組、中藥組，每組10只；另取10只同窩陰性小鼠作為對(duì)照組，中藥組給予加減薯蕷丸按每日14 g/kg(根據(jù)有效大鼠劑量[3-4]換算)灌胃，每日1次，連續(xù)28 d；模型組和對(duì)照組予以等容積生理鹽水灌胃。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

2.2.1 Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 灌胃28 d后，采用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，正式測(cè)驗(yàn)前4 d開始獲取訓(xùn)練：置于圓形水池，水下平臺(tái)位于第3象限，小鼠從第4象限入水，實(shí)時(shí)攝像監(jiān)測(cè)到達(dá)水下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，90 s內(nèi))，超過90 s未找到則予以長(zhǎng)桿引導(dǎo)至平臺(tái)，停留15 s后移出。如此連續(xù)訓(xùn)練4 d，第5天撤去水下平臺(tái)，進(jìn)行探索試驗(yàn)。實(shí)時(shí)攝像記錄時(shí)間段內(nèi)探索軌跡，通過分析軟件計(jì)算平臺(tái)跨越次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間百分比。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)海馬組織中Aβ42水平 將海馬組織在PBS中勻漿，然后用RIPA緩沖液進(jìn)行勻漿。根據(jù)說明書，通過特異性酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)Aβ42的濃度。

2.2.3 Western blot檢測(cè)海馬組織中CTSB、P62、LAMP1、LC3、TFEB蛋白水平 根據(jù)最小動(dòng)物樣本量及獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所需達(dá)到最低生物學(xué)重復(fù)，通過SPSS 19.0軟件計(jì)算，取其中6只進(jìn)行蛋白水平檢測(cè)。小鼠腹腔麻醉后直接斷頭取腦，冰上迅速分離雙側(cè)海馬用于組織總蛋白提取，將新鮮海馬組織剪碎，冰上研磨，加入組織裂解液后靜置30 min、4 ℃離心后取上清，加入上樣緩沖液裂解變性備用；同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[5]提取核內(nèi)蛋白：將新鮮海馬組織剪碎，冰上研磨，冰浴、離心后取下層沉淀物，對(duì)沉淀物重新進(jìn)行重懸，加入100～200 μL含Nonidet P40緩沖液，冰浴10 min，4 ℃離心，吸盡上清液后的沉淀部分是細(xì)胞核，再次加入50～100 μL普通緩沖液，4 ℃離心，所獲上清液即為細(xì)胞核蛋白。

每孔蛋白上樣量30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；按不同濃度(CTSB、P62濃度為1∶1 000，LAMP1、LC3濃度為1∶2 000，TFEB濃度為1∶250)稀釋一抗抗體，4 ℃過夜；1倍TBST液洗3次，每次5 min；二抗(1∶10 000)室溫?fù)u床1 h；1倍TBST液洗3次，每次10 min；ECL發(fā)光液使條帶可視化。Image J 1.41軟件測(cè)量條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 水迷宮定位航行第1～4天，每組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短。在第4天的實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組相比，中藥組小鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)象限停留時(shí)間占比均顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，中藥組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)象限停留時(shí)間占比明顯增多(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠游泳軌跡圖

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組小鼠海馬組織Aβ42含量比較 模型組小鼠海馬組織中Aβ42含量顯著高于對(duì)照組[(0.428±0.018)vs(0.208±0.013),P<0.05]；中藥組小鼠海馬組織中Aβ42含量為(0.277±0.014)，顯著低于模型組(P<0.05)。

3.3 各組小鼠海馬組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、LAMP1、CTSB蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，P62蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，LAMP1、CTSB蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，中藥組小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯變化(P>0.05)，LAMP1、CTSB蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠海馬組織CTSB、P62、LAMP1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 各組小鼠海馬組織細(xì)胞核內(nèi)TFEB表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織細(xì)胞核內(nèi)TFEB和總TFEB表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，中藥組海馬組織細(xì)胞核內(nèi)TFEB表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，總TFEB表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。見圖5、圖6。

圖5 Western blot檢測(cè)各組小鼠海馬組織細(xì)胞核內(nèi)TFEB及總TFEB表達(dá)水平

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

加減薯蕷丸源于漢代張仲景《金匱要略》中的薯蕷丸，由已故名老中醫(yī)呂繼端教授去其祛風(fēng)之藥，取其補(bǔ)中之效，同時(shí)加用補(bǔ)腎填精、化痰開竅藥物以切合癡呆脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)的病機(jī)化裁形成。在對(duì)小鼠行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)中，給予加減薯蕷丸干預(yù)4周后，小鼠的逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)均有不同程度改善，提示加減薯蕷丸可以改善APP/PS1模型的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

Aβ的生成和清除失衡被認(rèn)為是AD的核心病理改變，Aβ在腦內(nèi)的聚集可以引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞缺失和認(rèn)知功能損害[1]。自噬作為真核細(xì)胞重要的分解代謝過程，越來越多的研究顯示自噬在Aβ的產(chǎn)生和降解過程中起著重要作用，自噬功能異?？赡苁茿D的發(fā)病機(jī)制之一[6]。自噬體形成后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，以有效清除螯合的內(nèi)容物，這一過程即自噬-溶酶體途徑(autophagy lysosome pathway，ALP)。在AD中，ALP途徑呈進(jìn)行性下降[7]，蛋白質(zhì)降解受損，同時(shí)神經(jīng)突起存在自噬體和溶酶體內(nèi)細(xì)胞器的累積[8]。在受損神經(jīng)軸突中，β-分泌酶水平升高，斑塊形成增多[9]。自噬溶酶體功能障礙同時(shí)會(huì)引起內(nèi)吞淀粉樣前體蛋白囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長(zhǎng)，增加被β-分泌酶和γ-分泌酶切割傾向，導(dǎo)致Aβ生成增加[10-11]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組海馬Aβ42水平較對(duì)照組增加，同時(shí)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，提示腦內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白Aβ引起保護(hù)性自噬水平增加，但LC3Ⅱ水平升高同時(shí)可能是溶酶體功能障礙，下游清除功能受損的結(jié)果[12]；經(jīng)加減薯蕷丸干預(yù)后，海馬區(qū)Aβ42水平下降，中藥組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有增加，但與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明加減薯蕷丸可能通過促進(jìn)下游溶酶體降解，增加Aβ清除并減少LC3Ⅱ堆積。P62作為自噬底物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將泛素化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體并被溶酶體降解，當(dāng)自噬功能缺陷時(shí)，P62在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積[13]，與對(duì)照組相比，模型組P62水平明顯增加，表明6月齡(5月齡老鼠經(jīng)干預(yù)治療后月齡為6)APP/PS1小鼠開始出現(xiàn)溶酶體功能障礙，經(jīng)加減薯蕷丸干預(yù)后，中藥組P62蛋白累積得以部分緩解。CTSB是溶酶體主要的天冬酰胺蛋白酶，反映溶酶體降解功能，LAMP1可以直接反映自噬體和溶酶體的成熟度，經(jīng)加減薯蕷丸干預(yù)后，中藥組LAMP1、CTSB水平增加，結(jié)合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白水平也進(jìn)一步證明小鼠海馬區(qū)自噬溶酶體功能得以改善。

目前已有文獻(xiàn)表明，TFEB是ALP的主要調(diào)節(jié)因子，可以增加自噬和溶酶體基因的表達(dá)，刺激自噬體-溶酶體融合和自噬體內(nèi)容物的降解[14]。TFEB動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)ALP，增加TFEB表達(dá)是一種較高效率誘導(dǎo)自噬清除的途徑[15]。TFEB活性是通過磷酸化調(diào)節(jié)，TFEB磷酸化使其與伴侶蛋白14-3-3的結(jié)合并保持在細(xì)胞質(zhì)中無法發(fā)揮作用，而去磷酸化的TFEB/14-3-3復(fù)合物解離使TFEB轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活靶基因的作用[16]。在AD模型中，增加TFEB的核內(nèi)聚集可以加速淀粉樣蛋白前體蛋白在溶酶體中的降解，從而減少Aβ的產(chǎn)生和淀粉樣蛋白斑塊的沉積[11，17]。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，中藥組核內(nèi)TFEB明顯增加，表明加減薯蕷丸增加TFEB核內(nèi)移位，增加自噬溶酶體途徑清除錯(cuò)誤折疊蛋白能力，減少海馬區(qū)Aβ水平。

加減薯蕷丸方中山藥、熟地黃、制何首烏、杜仲、枸杞子、五味子滋補(bǔ)肝腎、填精益髓；黨參、白術(shù)、茯苓健脾益氣；石菖蒲、遠(yuǎn)志化痰開竅益智；白芍、當(dāng)歸、川芎活血祛瘀。全方共奏健脾補(bǔ)腎、化痰祛瘀、開竅益智之效。自噬與中醫(yī)痰瘀概念相似，衰老細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白屬于中醫(yī)內(nèi)生痰瘀之邪，痰瘀產(chǎn)生與自噬溶酶體功能障礙密切相關(guān)，有研究表明，多種活血化瘀藥物可以起到調(diào)節(jié)自噬的作用[18]。組方中遠(yuǎn)志、石菖蒲、芍藥等藥物有效成分可從不同角度增強(qiáng)自噬途徑，減少Aβ沉積[19]。綜上所述，加減薯蕷丸通過促進(jìn)TFEB核轉(zhuǎn)移增強(qiáng)自噬溶酶體途徑，減少海馬區(qū)Aβ42水平，改善APP/PS1模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。但AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而加減薯蕷丸可能還存在更多的作用靶點(diǎn)和影響機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。