木丹顆粒對高糖環(huán)境下人血管內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2/ARE信號通路的影響

李可月 ，李 都，王 鎂

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110032)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一[1]，作為缺血性心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，AS的防治對糖尿病患者臨床二級預(yù)防有著重要的意義。其發(fā)病機(jī)制之一血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激學(xué)說被學(xué)者廣泛認(rèn)同[2]。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(neclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)調(diào)控氧化應(yīng)激的重要信號通路，通路中Nrf2及血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等均具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的過度表達(dá)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞病理增生，對血管內(nèi)皮產(chǎn)生的損傷，可使AS進(jìn)一步發(fā)展[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)木丹顆粒對糖尿病患者AS有干預(yù)作用[5]。本研究在此基礎(chǔ)上觀察木丹顆粒對高糖環(huán)境下人血管內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2/ARE信號通路及血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討木丹顆粒對糖尿病AS的影響是否與Nrf2/ARE信號通路抗氧化應(yīng)激、減少VEGF含量有關(guān)。

1 材料

1.1 動物 SPF級6周齡雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(230±20)g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001，于遼寧長生生物技術(shù)有限公司采購。此實(shí)驗(yàn)已通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號：20161202)，操作步驟均符合中國倫理委員會動物研究相關(guān)指導(dǎo)原則。

1.2 細(xì)胞 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株(貨號 4200)：廣州吉妮歐生物科技有限公司，美國Sciencell研究實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液(批號 10040586R、AB10115027)：Hyclone公司；Trizol試劑(批號 14105)：Invitrogen公司；胎牛血清(批號 1108862)：Gibco公司；兔源β-actin一抗(批號 4970)：Cell Signaling公司；Prime Script?RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、ROX Plus試劑盒(批號 RR047A，RR82LR)：Takara公司；人VEGF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號 AE98006Hu)：AMEKO公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒(批號 P0019、P0018A、P0012AC、P0012S)：碧云天生物技術(shù)有限公司；顯影定影試劑盒；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒。

1.4 儀器 MCO-15AC型細(xì)胞培養(yǎng)箱：Sanyo公司；SW-CJ-1CU超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；MR1822型低溫高速離心機(jī)：Jouan SA公司；INFINITE M200型多功能酶標(biāo)儀：TECAN公司；DU640型蛋白核酸分析儀：Beckman公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-40C型轉(zhuǎn)移電泳儀：北京六一儀器廠；Stratagene Mx3000P型熒光定量PCR儀：Agilent公司；Chemi Imager 5500型凝膠成像分析系統(tǒng)：Alphainnotech Chemi Imager公司。

1.5 藥物 木丹顆粒(準(zhǔn)字號z20080033)：營口奧達(dá)制藥有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 解凍人血管內(nèi)皮細(xì)胞株，完全溶解復(fù)蘇后將其配制成細(xì)胞懸液，在96孔板及培養(yǎng)瓶中分種，將溫度設(shè)置成37 ℃恒溫，在濃度為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后吸除、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，在細(xì)胞呈單層貼壁生長后延長至每2～3 d換液，多次換液培養(yǎng)至細(xì)胞生長融合達(dá)80%。

2.2 細(xì)胞傳代 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，吸除瓶內(nèi)培養(yǎng)液并重復(fù)用PBS洗去殘留培養(yǎng)液2次，加入1 mL室溫胰蛋白酶，晃動培養(yǎng)瓶1～3 min后放至顯微鏡下，觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞間隙變大，胞質(zhì)回縮變圓時，立即拿入超凈工作臺加適量胎牛血清培養(yǎng)液以結(jié)束消化。采用無菌吸管輕輕吹打貼壁細(xì)胞表面，制細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)速1 800 r/min離心機(jī)進(jìn)行離心，10 min后結(jié)束，棄去上清，加入適量培養(yǎng)液，等量分種，置于恒溫培養(yǎng)箱中，靜止期時將其隨機(jī)分為3組。

2.3 制備含藥血清 將30只SPF級6周齡雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分3組(正常組、模型組、木丹顆粒組)，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，木丹顆粒組用每日2.3 g/kg的給藥劑量灌胃[6]，正常組和模型組大鼠用等容積生理鹽水灌胃，期間各組大鼠自由喂食，連續(xù)5 d。在第5天灌胃結(jié)束1 h后，各大鼠通過腹主動脈收集血液。將各組血液以3 000 r/min離心后，取血清，在56 ℃水浴中滅活補(bǔ)體40 min，除菌分裝后，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制模型以藥物作用最佳時間和最佳高糖濃度[7]，正常組以5 mmol/L葡萄糖+15%正常鼠血清培養(yǎng)，模型組以30 mmol/L葡萄糖+15%正常鼠血清培養(yǎng)，木丹顆粒組以30 mmol/L葡萄糖+15%木丹顆粒血清培養(yǎng)，1 d后收集細(xì)胞及上清液檢測指標(biāo)。

2.5 觀察指標(biāo)及方法

2.5.1 RT-PCR檢測Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)水平 取出人血管內(nèi)皮細(xì)胞，加入1 ml Trizol，根據(jù)說明提取總RNA，用核酸蛋白分析儀測3組各6份樣品的吸光度A，完成RNA的濃度測定，用電泳觀察RNA完整性。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明制備cDNA，備存于4 ℃溫度下。接下來以2×SYBR Green QPCR Master Mix 10 μL，RNase Free H2O 3.7 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。對照熒光染料0.3 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2 μL，Primer-BLAST[8]設(shè)計引物，引物序列見表1。獲取的Ct值根據(jù)Pfaffl MW[9]法計算待測目的基因的相對表達(dá)量。

2.5.2 Western blot檢測Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)水平 配置制備BCA工作液(稀釋對照品A∶B為50∶1)，取3組各6個樣品及各濃度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL加入EP管中，根據(jù)說明書提取、測定蛋白濃度。將蛋白與適量上樣緩沖液的混合液加熱變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h(5%脫脂奶粉)，加一抗(1∶3 000，4 ℃，過夜)，TBST洗膜3次后加二抗(1∶5 000，室溫，1 h)。孵育完成洗膜3次。以β-actin為內(nèi)參照，根據(jù)ECL發(fā)光法記錄曝光圖片，分析條帶灰度值。

2.5.3 ELISA檢測VEGF含量 根據(jù)ELISA說明書操作，使用INFINITE M200型多功能酶標(biāo)儀檢測3組每組8孔吸光度A(450 nm波長)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組VEGF含量。

3 結(jié)果

3.1 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞的Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，木丹顆粒組Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表2。

表2 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞的Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組人血管內(nèi)皮細(xì)胞的Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，木丹顆粒組Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖1、表3。

注：A.正常組；B.模型組；C.木丹顆粒組

表3 各組血管內(nèi)皮細(xì)胞的Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 各組人血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中VEGF含量比較 與正常組比較，模型組中VEGF含量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，木丹顆粒組中VEGF含量顯著減少(P<0.05)。見表4。

表4 各組人血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中VEGF含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

糖尿病患者AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有研究表明高糖環(huán)境激活的氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂均參與AS的發(fā)生發(fā)展[10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到環(huán)境刺激激活氧化應(yīng)激反應(yīng)時，產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)可過度氧化血管壁中的低密度脂蛋白，觸發(fā)凋亡程序，破壞血管壁的完整性[11]。高糖刺激也可誘導(dǎo)超氧化物的產(chǎn)生，其與內(nèi)皮來源的一氧化氮相互反應(yīng)產(chǎn)生的過氧亞硝酸鹽可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)及功能[12]。

Nrf2/ARE信號通路是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要信號通路[13]。Nrf2是該通路的始動激活劑[14]，ARE是人體內(nèi)多種抗氧化酶均含有的一個相同啟動子序列[15]。生理狀態(tài)下，胞漿中Nrf2與果蠅激動蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合，是無活性偶聯(lián)狀態(tài)，機(jī)體高糖環(huán)境氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2磷酸化與結(jié)合蛋白分離，轉(zhuǎn)位與特異的DNA-啟動子結(jié)合序列ARE結(jié)合[16]，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，激活后續(xù)基因?qū)O-1、γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶、超氧化物歧化酶等的表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS過量產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的自我保護(hù)作用，阻止動脈硬化進(jìn)展。Jiménezosorio等[13]研究表明，在2型糖尿病的病理狀態(tài)下，Nrf2會上調(diào)，改善氧化應(yīng)激，形成相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。

HO-1是Nrf2/ARE信號途徑重要的下游因子，也是體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[17]。Gou等[18]發(fā)現(xiàn)上調(diào)db/db小鼠HO-1含量以減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，以達(dá)到改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、防治AS的作用。VEGF是重要的促血管生成因子之一[19]，直接參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷徙和血管新生。AS的許多發(fā)病因素，如缺氧、高血糖及各種生長因子等均可加劇VEGF的合成并發(fā)揮作用[20]。VEGF在刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的同時還能促進(jìn)黏附因子和炎癥的表達(dá)，激活白細(xì)胞，釋放炎癥因子[21]，加重氧化應(yīng)激程度。有體外細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)，VEGF能促使血管內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)損傷血管[22]。

AS可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脈痹”“頭痛”“胸痹”“眩暈”等疾病的范疇，其病在血脈，屬于血脈病?！夺t(yī)林改錯》云：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于脈管，血管無氣，必停留而瘀?！薄端貑枴づe痛論》中提出“百病生于氣”。氣的功能失常，推動無力則血行不暢，致血脈不暢，久而生瘀。現(xiàn)代中醫(yī)也將血液高凝狀態(tài)、血管壁受損、脂質(zhì)斑塊形成、血栓形成等視為血瘀證，認(rèn)為血脈不通，血滯阻絡(luò)易致AS。故中醫(yī)學(xué)治療AS多以益氣、活血、通絡(luò)為治療基本原則。木丹顆粒是由黃芪、三七、赤芍、川芎、紅花等組成的具有益氣活血通絡(luò)功效，用于治療周圍神經(jīng)病變的上市中成藥。近期研究顯示木丹顆粒有減輕糖尿病患者血管慢性炎癥反應(yīng)、降低頸動脈內(nèi)膜中層厚度、抗AS等作用，對抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能有良好療效[23]?，F(xiàn)代研究顯示，三七能通過多種機(jī)制防治AS[24]。侯騰飛等[25]總結(jié)黃芪皂苷、川芎嗪、紅花黃色素A能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化，赤芍總苷則可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組Nrf2、HO-1的表達(dá)較正常組增多，這是高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞對氧化應(yīng)激所做出的代償性反應(yīng)。應(yīng)用木丹顆粒干預(yù)后，Nrf2、HO-1的表達(dá)水平較模型組上調(diào)，這是由于抗氧化酶受藥物影響進(jìn)一步活化發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。另外，模型組VEGF的含量明顯多于正常組，藥物干預(yù)后含量下降，可見高糖環(huán)境可刺激VEGF合成增多，而木丹顆粒能有效地抑制其含量的上調(diào)。

綜上所述，木丹顆粒在高糖環(huán)境下能通過活化Nrf2/ARE信號通路，抑制VEGF合成，減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，以達(dá)到抗AS的作用。