朱頂紅鱗莖組織培養(yǎng)中的抗褐化研究*

廖煥琴 鐘敏艷 徐 放 楊會肖 楊曉慧 陳新宇 張衛(wèi)華 潘 文 徐 斌

（1.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006）

朱頂紅（Hippeastrum rutilum），別名孤挺花、華胄蘭等，為石蒜科（Amaryllidaceae）朱頂紅屬（Hippeastrum）多年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯巴西一帶，花莖挺拔，花朵碩大，花色艷麗，觀賞價值高，深受國內(nèi)外消費者喜愛。相關(guān)研究表明朱頂紅及其分離的化學成分具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等功效，藥理作用豐富[1-2]。

朱頂紅常用的繁殖方法主要有自然分球、扦插和播種等，但是繁殖速度慢，難以滿足市場的需求。而采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行離體快繁，具有繁殖系數(shù)高、成苗時間短和便于商品化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢[3]。近年來研究者對朱頂紅組織培養(yǎng)進行了一系列研究。鄒水平等[4]、邵素娟等[5]、張亞玲等[6]、高年春等[7]以鱗莖作為外植體建立組培體系。張慧等[8]、于波等[9]、王春夏等[10]報道了以朱頂紅花梗和葉片等器官作為外植體成功獲得無菌苗。張夢迪[11]、黃敏[12]、Mujib A 等[13]就培養(yǎng)基類型、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等方面進行組培體系的優(yōu)化。朱頂紅鱗莖在組織培養(yǎng)過程中的褐化問題影響增殖速度，從而制約工廠化生產(chǎn)效率，但目前朱頂紅褐化相關(guān)研究鮮有報道，因此，研究朱頂紅抗褐化研究具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以廣東林業(yè)科學研究院組培中心長勢良好、色澤翠綠的朱頂蘭繼代苗為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基 分別配制以下培養(yǎng)基：（1）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠；（2）1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠；（3）KC+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠；（4）LS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠；（5）B5+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠，調(diào)pH 至5.8-6.2，共5 個處理，每個處理重復3次。在培養(yǎng)基上接種朱頂紅鱗莖，縱向切割，一分為二，培養(yǎng)溫度25 ℃，2 000 lx，光照12-16 h，培養(yǎng)30 d 后，觀察朱頂紅的褐變狀況及生長狀況，篩選適合的基本培養(yǎng)基。

1.2.2 低pH 水培 按胡慶等[14]配制4×（倍），6×（倍）和8×（倍）的不同離子強度的緩沖液。配制以下培養(yǎng)基：（1）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠+緩沖液4×（倍）；（2）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠+緩沖液6×（倍）；（3）MS+2.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1卡拉膠+緩沖液8×（倍）。共3 個處理，每個處理重復3 次。以增殖階段的朱頂紅無菌苗為試驗材料，縱向切割，一分為二，培養(yǎng)溫度25 ℃，2 000 lx，光照12-16 h，培養(yǎng)30 d 后，觀察朱頂紅的褐變狀況及生長狀況。

1.2.3 凝固劑種類、濃度和糖濃度 以MS+2.0 mg·L-16-BA 為培養(yǎng)基，凝固劑為卡拉膠、瓊脂粉A 和B 3 種，凝固狀態(tài)為液體、半固體和固體3 種，蔗糖為10，20，30 g·L-13 個濃度。采用正交試驗設(shè)計L9（34），各實驗因素及水平見表1，共9 個處理，每個處理重復3 次。以生長狀態(tài)一致的朱頂紅鱗莖為試驗材料，縱向切割，一分為二，培養(yǎng)30 d 后，觀察朱頂紅鱗莖的褐變狀況及生長狀況。1.2.4 抗褐化劑 在MS+2.0 mg·L-16-BA +卡拉膠6 g·L-1+蔗糖30 g·L-1培養(yǎng)基中分別添加不同種類和濃度的抗褐化劑：活性炭（AC），0、0.1、0.5、1.0 g·L-1、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），0、0.5、1.0、2.0 g·L-1，維生素C（VC），0、0.1、0.3、0.5 g·L-1、檸檬酸（CA），0、0.1、0.3、0.5 g·L-1，調(diào)pH 為5.8-6.2。以增殖階段的朱頂紅無菌苗為試驗材料，縱向切割，一分為二，培養(yǎng)溫度25 ℃，2 000 lx，光照12-16 h，每個處理重復3 次.培養(yǎng)30 d 后，觀察朱頂紅的褐變狀況及生長狀況。

表1 不同種類和濃度凝固劑及糖濃度的因素水平Tab.1 Type and concentration of coagulant, concentration of sucrose

1.3 統(tǒng)計方法

觀測指標為鱗莖褐化程度、培養(yǎng)基狀況、鱗莖生長狀況和增殖率。褐化等級劃分：＋，外植體無褐變，周圍培養(yǎng)基呈半透明狀；＋＋，外植體輕度褐變，切口處滲出褐色物質(zhì)，周圍培養(yǎng)基少許變色；＋＋＋，外植體中度褐變，切口處滲出褐色物質(zhì)，周圍培養(yǎng)基小范圍變色；＋＋＋＋，外植體較嚴重褐變，切口處滲出褐色物質(zhì)，周圍培養(yǎng)基大范圍變色；＋＋＋＋＋，外植體嚴重褐變，切口處滲出褐色物質(zhì)，周圍培養(yǎng)基大范圍深度變色。增殖率計算公式為：增殖率=接種后球數(shù)/接種前球數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用R3.6.3 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Duncan 法進行多重比較檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對朱頂紅繼代培養(yǎng)的影響

由表2 可知，朱頂紅鱗莖繼代培養(yǎng)30 d 后，MS 培養(yǎng)基中褐化程度最低，鱗莖輕度褐變，切口處滲出褐色物質(zhì)，周圍培養(yǎng)基小范圍變淺黃色，植株生長狀況良好，葉綠有光澤且較寬大，無黃葉，鱗莖粗壯且內(nèi)部緊實，其次是1/2MS、B5、KC 培養(yǎng)基；LS 培養(yǎng)基中朱頂紅鱗莖褐化程度最高，隨植株生長褐化越來越嚴重，周圍培養(yǎng)基變?yōu)樯詈稚?，葉色逐漸變成黃色，鱗莖較粗壯但內(nèi)部較疏松，有玻化現(xiàn)象，隨培養(yǎng)時間延長植株逐漸死亡?？傮w而言，MS 培養(yǎng)基宜作為基本培養(yǎng)基繼續(xù)進行朱頂紅鱗莖抗褐化研究。

表2 不同基本培養(yǎng)基對朱頂蘭繼代培養(yǎng)的影響Tab. 2 Effects of different basic medium on subculture of Hippeastrum rutilum

2.2 低pH 水培對朱頂紅繼代培養(yǎng)的影響

由表3 可知，與對照組（CK）相比，在不同酸度和離子強度的培養(yǎng)基上，植株褐化嚴重，所有處理增殖效果不好，增殖率最高僅為1.78，生長狀況差，植株逐漸枯萎死亡。綜上所述，低pH水培不適合朱頂紅的組織培養(yǎng)。

表3 低pH 水培對朱頂紅繼代培養(yǎng)的影響Tab. 3 Effects of low pH ydroponic culture on subculture of Hippeastrum rutilum

2.3 凝固劑種類、濃度和糖濃度對朱頂蘭繼代培養(yǎng)的影響

從表4 中植株褐化程度和培養(yǎng)基狀況來看，處理4 和5 抗褐化效果較好，植株鱗莖輕度褐變，周圍培養(yǎng)基呈半透明狀態(tài)；處理5 植株鱗莖生長快，粗壯，無?；F(xiàn)象，葉淺綠，寬大且無黃葉，長勢較好，而處理4 鱗莖?；F(xiàn)象嚴重，生長狀況一般；在所有處理中，處理9 抗褐化效果最差，植株鱗莖重度褐變，周圍培養(yǎng)基顏色擴散范圍較大，呈褐色，生長狀況也較差，鱗莖弱小且?；瘒乐亍Ｒ虼颂幚? 抗褐化效果最理想。

表4 不同種類和濃度凝固劑及糖濃度對朱頂紅繼代培養(yǎng)的影響Tab. 4 Effects of different type and statue of coagulant, different concentration of sucrose on subculture of Hippeastrum rutilum

從表5 中增殖率可知，處理5 增殖率最高，達到4.11，其次為處理3、處理7 和處理9，增殖率分別為4.0、3.89 和3.78，四者之間無顯著性差異，但處理5 與其他五個處理間差異顯著；從極差分析看，蔗糖濃度的極差最大，達到1.036，對朱頂紅鱗莖的增殖率影響最大，3 種因素對朱頂紅鱗莖增殖率作用的主次順序為蔗糖濃度＞凝固劑種類＞凝固劑濃度；方差分析結(jié)果表明,蔗糖濃度對朱頂紅鱗莖增殖率的影響達極顯著水平（P＜0.05），而凝固劑類型和凝固劑濃度對朱頂紅鱗莖增殖的影響都不顯著?？傮w而言，處理5 即MS+2.0 mg·L-16-BA +30 g·L-1蔗糖+1.8 g·L-1瓊脂粉A 適合朱頂紅鱗莖組織培養(yǎng)。

表5 不同種類和濃度凝固劑及糖濃度對增殖率的影響Tab. 5 Effects of different type and concentration of coagulant, different concentration of sucrose on proliferation rate

2.4 抗褐化劑對朱頂紅繼代培養(yǎng)的影響

由表6 可知，CK 處理中不添加抗褐化劑，朱頂紅鱗莖褐變較為嚴重，滲出較多黃色物質(zhì)于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基呈黃色，植株長勢一般，隨AC 濃度增加朱頂紅鱗莖褐變逐漸減輕，培養(yǎng)基由淺黃至透明，在活性炭濃度為1.0 g·L-1，葉色呈綠有光澤，鱗莖生長較快和粗壯，無?；?，無黃葉出現(xiàn)，長勢良好，增殖率最高值為處理4 達到 4.58；朱頂紅鱗莖隨PVP 濃度增大褐變程度增加，當PVP 濃度為0.5 和1.0 g·L-1時表現(xiàn)出較高的增殖率，分別為4.5 和4.25，當濃度增至2.0 g·L-1時培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量黃褐色物質(zhì)，植株長勢很差；在添加VC 和CA 的培養(yǎng)上朱頂紅鱗莖生長狀況一般，且?；瘒乐?。綜上所述，在繼代培養(yǎng)基中添加1.0 g·L-1活性炭可有效抑制朱頂紅鱗莖的褐化。

表6 不同種類和濃度抗褐化劑對朱頂紅繼代培養(yǎng)的影響Tab. 6 Effects of different anti-browning agent on subculture of Hippeastrum rutilum

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)過程中所需的營養(yǎng)皆來自培養(yǎng)基，且不同的基本培養(yǎng)基其營養(yǎng)成分與含量有所不同。因此，選擇適合的基本培養(yǎng)基對朱頂紅繼代培養(yǎng)的順利進行尤為重要。近年來學者們對朱頂紅組織培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基進行了探討，但得出來的結(jié)論不盡相同[15]。本次試驗結(jié)合褐化現(xiàn)象和生長狀況來看，朱頂紅鱗莖在MS 培養(yǎng)基上抗褐化效果較KC、1/2MS、LS、B5 好，而李靜[16]發(fā)現(xiàn)1/2MS 培養(yǎng)基更有利于繼代和壯苗培養(yǎng)。

在植物組織培養(yǎng)中，pH 值會影響植物的褐變、生長與增殖。試驗結(jié)果表明低pH 水培（pH為3.2）并不能抑制朱頂紅鱗莖的褐化，且不利于朱頂紅的生長與增殖。

在凝固劑種類、濃度和糖濃度的正交試驗中，所用凝固劑由不同公司所提供，可能由于其成分和來源有所不同，導致植物在組培過程其生長狀況不同。在本試驗中，從朱頂紅鱗莖抗褐化效果、生長狀況和增殖率來看，添加瓊脂粉A 和30 g·L-1蔗糖效果最佳，但就成本而言，以卡拉膠為凝固劑，添加適量活性炭抑制褐化較低廉，宜推廣用于工廠化生產(chǎn)。

在組織培養(yǎng)過程中最理想的抗褐化劑是既能控制褐化又不影響植物的正常生長。在本試驗中AC 表現(xiàn)出良好的抗褐化作用，且不影響增殖，這與王培軍[17]研究結(jié)果相似。添加PVP 后鱗莖抗褐化效果差，且植株長勢差，但濃度為0.5 和1.0 g·L-1時增殖率分別達到4.25 和4.5，因此在篩選適宜的抗褐化劑時，應(yīng)實現(xiàn)抗褐化效果、增殖和生長狀態(tài)三者之間的平衡。