外泌體在骨再生及骨疾病領(lǐng)域的研究進(jìn)展

楊 爍，溫 寧

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853

近年來(lái)，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)在骨缺損修復(fù)與再生領(lǐng)域中展現(xiàn)了良好的修復(fù)效果以及廣闊的應(yīng)用前景。但是干細(xì)胞治療的局限性也受到越來(lái)越多的關(guān)注，如倫理限制、免疫排斥反應(yīng)、突變致瘤性等[1]。最近的研究表明外泌體具有與其來(lái)源細(xì)胞相似的生物學(xué)效應(yīng)，可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)的替代物應(yīng)用于骨組織修復(fù)，從而規(guī)避直接使用干細(xì)胞帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)“無(wú)細(xì)胞治療”[2]。另外，外泌體也可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，在骨疾病的發(fā)生、發(fā)展以及診斷中扮演重要角色[3]。本文就外泌體在骨再生及骨疾病領(lǐng)域的研究做一綜述，以期為外泌體的臨床應(yīng)用提供參考。

1 外泌體對(duì)骨缺損修復(fù)與再生作用

外泌體是細(xì)胞囊泡的一種，最早于1983年在網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并在1987年被命名為“exosome”[4]。外泌體的直徑為30 ～ 150 nm，可由多種細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、B細(xì)胞)所分泌并廣泛存在于血液、尿液、唾液等體液中[5]。外泌體的結(jié)構(gòu)主要是磷脂雙分子層及其所包含的內(nèi)容物如mRNA、miRNA、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[6]。外泌體可以將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞，從而發(fā)揮細(xì)胞間通訊的作用，同時(shí)影響細(xì)胞的微環(huán)境并調(diào)節(jié)細(xì)胞相應(yīng)的生理功能。目前的研究表明，外泌體不但能參與組織的修復(fù)再生，還在疾病診斷、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)以及藥物靶向運(yùn)輸?shù)阮I(lǐng)域發(fā)揮作用[7]。

骨重建是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵。在骨重建中涉及到許多與骨相關(guān)的細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞[8]。除了骨相關(guān)細(xì)胞，其他細(xì)胞系統(tǒng)如免疫細(xì)胞(T細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞和單核細(xì)胞)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞在骨重建中同樣發(fā)揮重要作用[9]。鑒于骨重建是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，如何控制這些細(xì)胞之間的通訊對(duì)骨再生是極其重要的環(huán)節(jié)。細(xì)胞間通訊的一種途徑是通過(guò)細(xì)胞間直接接觸來(lái)傳遞信號(hào)并調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理功能，另一種途徑則是通過(guò)體液循環(huán)中一些可溶性介質(zhì)來(lái)進(jìn)行信號(hào)傳遞[10]。目前的研究表明外泌體在信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，能夠影響多種細(xì)胞的功能來(lái)參與骨組織的修復(fù)與再生[11]。

1.1 外泌體促進(jìn)BMSCs成骨分化 研究表明，外泌體內(nèi)的miRNA在MSC成骨分化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)MSC來(lái)源外泌體的miRNA分析表明，在MSC成骨細(xì)胞分化過(guò)程中9個(gè)miRNA(let-7a，miR-199b，miRNA-218，miRNA-148a，miRNA-135b，miRNA-203，miRNA-219，miRNA-299-5p和 miRNA-302b)被 上 調(diào)，5種 miRNA(miR-221，miR-155，miR-885-5p，miR-181a和 miR-320c)被下調(diào)，以上這些miRNA都在成骨分化以及礦化中發(fā)揮作用[12]。Narayanan等[13]提取了經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后BMSCs的外泌體，并將其加入到hBMSCs培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，在2D培養(yǎng)條件下外泌體可以促進(jìn)BMP9及TGF-β1基因的表達(dá)；而在3D培養(yǎng)條件下，外泌體可以促進(jìn)OCN、RunX2基因的表達(dá)。除了BMSCs之外目前還有多種MSC來(lái)源的外泌體被證明在BMSCs成骨分化中發(fā)揮作用。如人誘導(dǎo)多能干細(xì) 胞 (human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose mesenchymal stem cells，hAMSCs)來(lái)源的外泌體等[14-15]。

1.2 外泌體調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和活性 外泌體可以通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和活性來(lái)促進(jìn)骨再生。研究表明，MSC來(lái)源的外泌體可以直接被成骨細(xì)胞攝入，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)GLUT3和MAPK通路相關(guān)蛋白的合成[16]。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)人成骨前體細(xì)胞的增殖和遷移，并且可以上調(diào)成骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原、OPN、RunX2等的表達(dá)水平。此外，外泌體還可將miRNA(如miRNA-196a)轉(zhuǎn)運(yùn)至成骨細(xì)胞，并對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和活性產(chǎn)生影響[17]。研究發(fā)現(xiàn)從高度礦化的MC3T3-E1細(xì)胞提取的外泌體中有43個(gè)miRNA高表達(dá)，包括miR-30d-5p、miR-133b-3p和miR-140-3p，這些miRNA在功能上被確定參與調(diào)節(jié)骨組織的重塑過(guò)程，并被認(rèn)為可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt、TGF-β和鈣離子信號(hào)通路，參與成骨細(xì)胞的分化和多種生理功能[18]。

1.3 外泌體促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化 骨再生中骨基質(zhì)礦化是一個(gè)十分重要的生理過(guò)程。Narayanan等[13]研究發(fā)現(xiàn)MSC來(lái)源的外泌體可以直接結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白(如Ⅰ型膠原及纖連蛋白)從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化。Qi等[14]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，hiPSCs來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs的增殖，提高其成骨分化過(guò)程中ALP活性及Ⅰ型膠原、OPN、RunX2等基因的表達(dá)水平，并促進(jìn)骨基質(zhì)礦化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可將人成骨細(xì)胞的增殖活性提高1.5倍，提高ALP活性并促使其產(chǎn)生更多的鈣沉積物[19]。

1.4 外泌體促進(jìn)血管新生 血管新生在骨再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能。新生血管不僅可以運(yùn)送氧氣和重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖及骨基質(zhì)礦化[20]。Zhu等[21]在體外研究中發(fā)現(xiàn)hAMSCs來(lái)源的外泌體具有促進(jìn)血管生成的作用，通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該外泌體中包含了對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成有重要調(diào)節(jié)作用的miRNAs(miR-126、miR-130a和miR-132)。在另一項(xiàng)體外研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)人胎盤(pán)MSC來(lái)源外泌體可以通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移來(lái)促進(jìn)血管形成[22]。另外，Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)hiPSCs細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)激活PI3K/Akt通路來(lái)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及成血管作用。體內(nèi)研究中，Xie等[24]將大鼠BMSCs來(lái)源外泌體與組織工程支架材料結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠有效促進(jìn)骨再生及血管再生。Zhang等[25]將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體用于大鼠骨折模型中觀察其對(duì)骨折的愈合效果，結(jié)果表明外泌體能夠通過(guò)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管形成，進(jìn)而加速骨折愈合。

2 外泌體在骨疾病中的作用

骨形成和骨吸收是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵。當(dāng)這個(gè)平衡被打破之后就會(huì)發(fā)生很多與骨相關(guān)的疾病。多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性溶骨性骨疾病，它的特征是破骨細(xì)胞活性過(guò)高和成骨細(xì)胞活性不足。骨髓來(lái)源的細(xì)胞與MM細(xì)胞之間的通訊在骨質(zhì)吸收和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[26]。MM細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的募集以及破骨活動(dòng)的進(jìn)行，同時(shí)MM患者的BMSCs來(lái)源外泌體能夠促進(jìn)骨髓瘤的增殖，而健康人來(lái)源的BMSCs外泌體則能抑制MM細(xì)胞的增殖及血管生成[27]。

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)而嚴(yán)重的疾病，它的特點(diǎn)是骨密度下降，患者骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。外泌體可以通過(guò)影響骨代謝過(guò)程而影響骨質(zhì)疏松進(jìn)程。破骨細(xì)胞外泌體中的miR-214-3p能夠影響成骨分化以及骨形成[28]。Yavropoulou等[29]研究發(fā)現(xiàn)骨密度較低的絕經(jīng)后婦女血清中的miR-21-5p水平要低于對(duì)照組婦女。此外，在一項(xiàng)研究中學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者以及小鼠血清中破骨細(xì)胞來(lái)源外泌體的miR-214表達(dá)顯著高于正常人及小鼠，該研究發(fā)現(xiàn)miR-214可通過(guò)外泌體作用于成骨細(xì)胞并抑制其成骨活性[30]。

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)同樣是骨科的一種常見(jiàn)病，它的特征是嚴(yán)重的關(guān)節(jié)軟骨退行性變，在女性中非常普遍。OA的早期診斷較難，而且目前針對(duì)OA的治療方案也比較有限?；ひ褐饕挥陉P(guān)節(jié)腔內(nèi)，能夠與關(guān)節(jié)軟骨直接接觸。研究認(rèn)為滑膜液參與了OA的病理過(guò)程[31]。最近的研究已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注滑膜液中外泌體在OA的發(fā)生以及早期診斷中所發(fā)揮的作用。研究表明，當(dāng)OA患者滑膜液中外泌體被關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)吞后，細(xì)胞會(huì)低表達(dá)與軟骨基質(zhì)形成相關(guān)的基因如蛋白聚糖、Ⅱ型膠原，高表達(dá)炎癥相關(guān)基因如IL-6。此外，OA患者外泌體中miRNA的含量也展現(xiàn)出性別特異性。女性患者中有許多與雌激素反應(yīng)相關(guān)的miRNAs，如 miR-181d-3p、miR-185-5p以 及 miR-7107-5p，這也預(yù)示篩查這些性別特異性miRNAs可作為早期診斷OA的途徑[32]。

3 外泌體的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

鑒于外泌體在組織再生以及細(xì)胞通訊中的重要作用，其具體應(yīng)用開(kāi)始受到越來(lái)越多的關(guān)注。在骨組織工程中，越來(lái)越多的研究開(kāi)始用外泌體代替間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行骨修復(fù)。相比于直接應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行治療，外泌體具有以下有點(diǎn)：1)安全性高。外泌體治療可以避免直接應(yīng)用干細(xì)胞所產(chǎn)生的突變致瘤、免疫排斥及血管栓塞等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。2)易于運(yùn)輸及保存。外泌體膜結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)其內(nèi)容物，在體外-80℃條件下可以長(zhǎng)期保存且不損失效力。3)免疫原性低。外泌體可以跨質(zhì)膜運(yùn)輸，極少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。4)作用效率高。外泌體可以直接被靶細(xì)胞攝入并作用于靶細(xì)胞，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[33-34]。Qin等[17]將BMSCs來(lái)源的外泌體注射到大鼠顱骨缺損模型中來(lái)觀察骨修復(fù)效果，結(jié)果表明顱骨缺損的愈合明顯加快。Qi等[14]將hiPS來(lái)源外泌體與β-磷酸三鈣支架材料相復(fù)合用于修復(fù)大鼠顱骨缺損，結(jié)果表明外泌體復(fù)合支架材料組的修復(fù)效果要明顯好于單純的支架材料組，作者通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)BMSCs體外成骨效果。Li等[35]將聚多巴胺修飾的PLGA材料作為載體負(fù)載人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體來(lái)進(jìn)行骨修復(fù)，也取得了不錯(cuò)的成骨效果。

除了在組織工程中的應(yīng)用，由于在病理狀態(tài)下外泌體內(nèi)容物的表達(dá)水平與正常狀態(tài)有所不同，再加上外泌體易于收集且較穩(wěn)定的特點(diǎn)，利用外泌體作為早期骨骼疾病的診斷成為一種可能。外泌體同樣可以被作為一種治療方法用于某些疾病的治療，如當(dāng)骨質(zhì)疏松患者發(fā)生骨折時(shí)，BMSCs來(lái)源的外泌體可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs(如miR-21、miR-4532及miR-125b-5p)來(lái)加速骨折的愈合[36]。此外，由于外泌體具有納米化尺寸、高生物相容性以及與細(xì)胞膜特異性結(jié)合的能力，可以把外泌體作為特異性藥物的運(yùn)輸載體來(lái)靶向治療特定疾病。如位于外泌體表面的EphrinA2能夠特異性結(jié)合成骨細(xì)胞表面受體，在骨質(zhì)疏松患者中可以通過(guò)向外泌體中加載治療藥物如甲狀旁腺激素來(lái)調(diào)控患者成骨細(xì)胞的功能進(jìn)而達(dá)到治療目的[30]。

盡管外泌體在骨再生及骨相關(guān)疾病的診斷及治療等方面開(kāi)辟了新的研究領(lǐng)域，但是其具體應(yīng)用中仍有許多問(wèn)題等待我們?nèi)ソ鉀Q。如何提取高純度的外泌體來(lái)保證診斷的準(zhǔn)確性以及提高治療效果是目前面臨的難題，目前的提取方法如超速離心、密度梯度離心以及試劑盒法等都不能最大限度地提高外泌體的純度。此外，如何提高外泌體的靶向運(yùn)輸能力以及提升外泌體的作用效率也是目前外泌體療法應(yīng)用的關(guān)鍵。因此外泌體的臨床應(yīng)用還需要更多的探索。