兩種方法制備納米金原位增敏金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)的比較*

孫衛(wèi)民，康嘉樂(lè)，鄧 聰，林 敏，任鵬麗

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510260

金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)作為一種臨床快速檢測(cè)技術(shù)，因其省去了標(biāo)本預(yù)處理步驟，以及大型儀器設(shè)備檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理和傳輸?shù)却罅糠爆嵉倪^(guò)程，可直接快速地得到可靠的結(jié)果，廣泛應(yīng)用于臨床。目前床旁金標(biāo)免疫層析試紙條大多采用肉眼直接判讀，結(jié)果易受標(biāo)本中的水或血、標(biāo)記物納米金等滲透不均的干擾，且大多適用于定性或半定量檢測(cè)，使其應(yīng)用范圍受到一定限制[1-2]。由于納米金顆粒直徑偏小，影響肉眼觀察的靈敏度。因此，該技術(shù)雖然操作簡(jiǎn)便、成本低，但其靈敏度不夠高，易導(dǎo)致誤檢和漏檢，留下安全隱患。為提高金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)的靈敏度，有研究通過(guò)生物素親和素系統(tǒng)，免疫金銀染色法進(jìn)行銀加強(qiáng)試驗(yàn)，對(duì)膜進(jìn)行化學(xué)修飾和對(duì)二抗進(jìn)行修飾制作增敏劑等技術(shù)，在一定程度上提高了試驗(yàn)的靈敏度[3-5]。但這些方案操作復(fù)雜、試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)、成本高，不太適合實(shí)時(shí)快速的臨床床邊檢測(cè)。因此，構(gòu)建既靈敏又快速的檢測(cè)技術(shù)成為亟待攻克的技術(shù)難題。本研究以血漿絨毛膜促性腺激素(HCG)金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以改性溶液做預(yù)處理，鹽酸羥胺和抗壞血酸兩種還原劑還原氯金酸制備納米金顆粒，在原位上增大納米金的粒徑，以期提高金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)靈敏度。比較這兩種化學(xué)方法制備納米金的增敏效果，找出相對(duì)合適制備納米金增敏金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)的方法，為提高金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)靈敏度，擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Precisa240A電子分析天平、金標(biāo)免疫層析試紙條購(gòu)自北京藍(lán)十字生物藥業(yè)有限公司；鹽酸羥胺(分析純)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑公司；抗壞血酸購(gòu)自湖南省婁底市化學(xué)品有限公司；氯金酸(分析純)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；磷酸鹽緩沖液購(gòu)自蘇州賽默飛世爾儀器有限公司；吐溫20購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；壬基酚聚氧乙烯醚購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1改性溶液的配制 100 mL的磷酸鹽緩沖液加入CaCl2和MgCl2使終濃度分別為1.0 mmol/L和0.5 mmol/L，同時(shí)加入1 mL吐溫20和1 mL壬基酚聚氧乙烯醚，充分混勻備用。

1.2.2鹽酸羥胺增敏法 A液：用去離子水配制1%的氯金酸；B液：用磷酸鹽緩沖液配制0.4 mol/L鹽酸羥胺。

1.2.3抗壞血酸增敏法 A液：用去離子水配制1%的氯金酸；B液：用磷酸鹽緩沖液配制0.5%抗壞血酸。

1.2.4標(biāo)本制備 將患者血漿(HCG濃度為256.800 0 mIU/mL)用生理鹽水倍比稀釋為：未稀釋、1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320(濃度依次約：256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL、15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL、3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL、0.802 5 mIU/mL)，再以雅培I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)結(jié)果為陰性的血漿作為陰性對(duì)照。按金標(biāo)免疫層析試紙條說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)，檢測(cè)完畢后用照相機(jī)拍照存檔。

1.2.5HCG測(cè)定增敏下限的確定 待試紙條按1.2.4檢測(cè)完畢，將樣品墊、金標(biāo)墊和上端的吸水紙剪掉，注意不要損傷硝酸纖維素膜。將各試紙條分別放入改性溶液浸泡5 min，取出用去離子水沖洗干凈，用吸水紙吸去多余的水分，讓試紙條保持一定的傾斜角度，先加A液10 μL氯金酸溶液，再加B液80 μL鹽酸羥胺溶液或80 μL抗壞血酸溶液，使其沿試紙條依次通過(guò)測(cè)試線和控制線，10 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用EXCEL軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié) 果

2.1HCG測(cè)定增敏下限的確定試驗(yàn) 結(jié)果表明抗壞血酸組：未增敏前以>25.000 0 mIU/mL為陽(yáng)性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL為弱陽(yáng)性，其余均為陰性。增敏后以>6.400 0 mIU/mL為陽(yáng)性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL、15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL均出現(xiàn)陽(yáng)性帶，且顏色逐漸偏低，3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL和陰性對(duì)照顯示陰性結(jié)果。兩次檢測(cè)結(jié)果比較顯示基于納米金增敏HCG檢測(cè)下限可達(dá)6.420 0 mIU/mL，相對(duì)增敏前，靈敏度提高約4倍。

鹽酸羥胺組：未增敏前以>25.0000 mIU/mL為陽(yáng)性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL為弱陽(yáng)性，其余均為陰性。增敏后以>6.400 0 mIU/mL為陽(yáng)性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL、15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL、3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL均出現(xiàn)陽(yáng)性帶，且顏色逐漸偏低，0.802 5 mIU/mL和陰性對(duì)照顯示陰性結(jié)果。兩次檢測(cè)結(jié)果比較顯示基于納米金增敏HCG檢測(cè)下限可達(dá)1.605 0 mIU/mL，相對(duì)增敏前，靈敏度提高約16倍。

2.2重復(fù)性試驗(yàn) 將6.420 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL溶液按鹽酸羥胺還原法繼續(xù)用同一批次的金標(biāo)免疫層析試紙條分別作4份檢測(cè)，連續(xù)5 d，檢測(cè)結(jié)果均穩(wěn)定不變，表明該技術(shù)增敏結(jié)果重復(fù)性較滿意。

3 討 論

金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)以納米金作為示蹤標(biāo)記物，把納米金顆粒光學(xué)檢測(cè)的靈敏度及免疫反應(yīng)的特異度相結(jié)合，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)。因其簡(jiǎn)便、快速、安全，在急診醫(yī)學(xué)、輸血醫(yī)學(xué)、現(xiàn)場(chǎng)診斷及個(gè)體自我體檢等方面廣泛應(yīng)用，是床旁檢驗(yàn)的主要技術(shù)手段。金標(biāo)免疫層析試紙條的吸水墊處加待測(cè)液體樣品，液流向試紙條的測(cè)試區(qū)移動(dòng)，液流經(jīng)過(guò)結(jié)合釋放區(qū)時(shí)，膜上預(yù)固的金標(biāo)特異性抗體(或抗原)被溶解，與待測(cè)物反應(yīng)而形成金標(biāo)抗原抗體復(fù)合物。液流前移至檢測(cè)區(qū)，其上的抗體(或抗原)結(jié)合并固定納米金標(biāo)記的復(fù)合物，通過(guò)納米金標(biāo)記物濃集呈現(xiàn)紫紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)[6]。該檢測(cè)技術(shù)雖優(yōu)勢(shì)很突出,但因依靠其自身所具有的顏色進(jìn)行結(jié)果判斷，需顆粒大量聚集達(dá)到肉眼可見(jiàn)的效果。臨床中部分標(biāo)本因水平低，結(jié)合的金標(biāo)抗體少，肉眼觀察時(shí)呈現(xiàn)很淺的顏色甚至無(wú)法識(shí)別，因此判斷為陰性，實(shí)則是假陰性結(jié)果。因此，該方法檢測(cè)靈敏度較低，從而限制了金標(biāo)免疫層析試紙條在臨床對(duì)檢測(cè)靈敏度要求較高項(xiàng)目中的應(yīng)用[7]。

為提高金標(biāo)免疫層析試紙條的靈敏度,研究人員進(jìn)行了多方面的嘗試，通過(guò)研制產(chǎn)生特定光、電或磁信號(hào)的納米材料,增強(qiáng)反應(yīng)信號(hào)，提高增敏效果[8-12]。本研究采用已在臨床使用成熟的HCG試劑為基礎(chǔ)作增敏研究。試驗(yàn)中未增敏時(shí)HCG濃度為15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL、3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL均表現(xiàn)為陰性。當(dāng)使用改性溶液處理金標(biāo)免疫層析試紙條表面，分別采用鹽酸羥胺與氯金酸和抗壞血酸與氯金酸兩種方式在試紙條原位制備納米金，試紙條檢測(cè)區(qū)原本少量的納米金結(jié)合新產(chǎn)生的納米金，呈黑褐色，從而放大檢測(cè)信號(hào)，肉眼可判斷，其中抗壞血酸還原法檢測(cè)靈敏度提高約4倍，鹽酸羥胺還原法檢測(cè)靈敏度提高約16倍。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了筆者前期原位增敏的推斷[13]。氯金酸水溶液中的金離子在不同還原劑的作用下還原成金原子，并聚集成微小的金核，在其表面吸附負(fù)離子(AuCl2-)和部分正離子(H+)形成吸附層，依靠靜電作用形成穩(wěn)定的膠體溶液。使用改性溶液破壞金核表面的吸附層，使新制備的金核與標(biāo)記單克隆抗體的膠體金顆粒結(jié)合，在試紙條的檢測(cè)區(qū)形成更大的“金殼”,隨著膠體金粒徑的增大，膠體金顏色加深，表現(xiàn)為黑褐色，從而放大檢測(cè)信號(hào)，提高肉眼的判讀能力，達(dá)到增敏的效果。

本研究提高了肉眼判讀金標(biāo)結(jié)果的靈敏度，但不同判讀者肉眼判讀的主觀性差異較大，判讀結(jié)果的誤差也較大，仍存在一些局限性。因此將該增敏方案聯(lián)合特定的免疫檢測(cè)儀器，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，避免肉眼判讀的主觀誤差，以及這兩類增敏方法在不同項(xiàng)目或不同廠家的金標(biāo)免疫層析技術(shù)上的普遍適用性等方面作進(jìn)一步研究，將更有助于提高其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，快速氧化還原法制備納米金對(duì)金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)有一定增敏效果，不同的還原劑增敏效果不同。其中鹽酸羥胺還原法制備納米金對(duì)血漿HCG金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)相對(duì)抗壞血酸還原法增敏倍數(shù)較高，重復(fù)性較好，試驗(yàn)結(jié)果可靠，更加適合用于制備納米金以達(dá)到增敏金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)的目的，為擴(kuò)大金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)的應(yīng)用范圍提供一定的基礎(chǔ)。