痹痛凝膠貼膏提取工藝和基質(zhì)配方研究

李智勇，王洛臨，張建軍，陳玉興，盧 泳,3

（1.廣東省第二中醫(yī)院廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405）

痹痛膏為廣東省第二中醫(yī)院的臨床驗方，主要由兩面針、制川烏、桂枝、生姜等中藥組成，具有祛風(fēng)除濕，溫陽散寒，通絡(luò)止痛的功效，用于頸腰腿痛、四肢骨關(guān)節(jié)疼痛屬風(fēng)寒濕痹型者。根據(jù)臨床的需求，現(xiàn)將其開發(fā)成現(xiàn)代經(jīng)皮給藥制劑凝膠貼膏，本研究對制備工藝進行篩選研究，為制劑生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試驗設(shè)備與儀器 DC-NSG-30 型多功能提取濃縮機組（上海達程）；Agilent1200系列高效液相色譜儀（美國），Agilent extend XDB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），METTLER XS-205DU型電子分析天平（瑞士），DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒），BT-S-1 型小型試驗巴布劑膏涂布機（溫市皓豐），BBV-T 型初黏力測試儀（濟南格瑞特），持黏力測試儀（濟南格瑞特）。

1.2 試藥 試驗所用飲片均由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；氯化兩面針堿（110848-200603）購自中國藥品生物制品檢定所；麝香追風(fēng)膏（批號：A14031，國藥準(zhǔn)字：Z44020391，廣東湛江吉民藥業(yè)股份有限公司）；冰醋酸（批號：20131216，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.3 動物 SPF 級NIH 小鼠，雌雄各半，實驗設(shè)施合格證號為SCXK（粵）2013-0002，動物合格證號為44007200012462，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。本實驗使用SPF 級動物實驗室，設(shè)施使用許可證號為SYXK（粵）2010-0059。

2 試驗與結(jié)果

2.1 提取工藝路線篩選

2.1.1 提取工藝路線方案 根據(jù)文獻分析，可以明確同痹痛凝膠貼膏功效主治相關(guān)的主要藥理作用為抑菌抗炎、解痙、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、解熱、抗過敏、抗變態(tài)反應(yīng)、改善微循環(huán)等，其相關(guān)的主要有效成分生物堿[1-3]、黃酮[4-5]、揮發(fā)油[6]等主要存在于揮發(fā)油和水提取液中。因此擬定不同的提取工藝路線，采用其對冰醋酸所致小鼠疼痛扭體反應(yīng)的影響作為評價指標(biāo)進行工藝路線篩選。

2.1.2 供試品的制備 樣品一：按處方比例，稱取飲片304.5 g，生姜榨汁；其余藥味煎煮2 次，每次加10 倍量水，煮沸1 h，合并煎液濾過，濾液濃縮至相對密度至1.15～1.20（60 ℃）的清膏，加入生姜汁和5%的卡波姆溶液，混勻，制成1 g 樣品相當(dāng)于0.765 g 飲片，備用。樣品二：按處方比例，稱取飲片304.5 g，生姜榨汁；桂枝等蒸餾法提取收集揮發(fā)油，藥渣與其余飲片煎煮2 次，每次加10 倍水，煮沸1 h，提取液與提取揮發(fā)油的水溶液合并，濾過，濾液濃縮至相對密度至1.15～1.20（60 ℃）的清膏，加入揮發(fā)油、生姜汁、5%的卡波姆溶液，混勻，制成1 g 樣品相當(dāng)于0.798 g 飲片，即得。樣品三：按處方比例，稱取飲片304.5 g，生姜榨汁，其余藥味粉碎成細粉，加入5%的卡波姆溶液中，混勻，制成1 g 樣品相當(dāng)于0.278 g 飲片，即得。

2.1.3 不同工藝樣品對冰醋酸所致小鼠疼痛扭體反應(yīng)的影響 實驗前動物去毛：實驗前1 日將小鼠背部先用嬰兒電動理發(fā)推去毛，再用8%的硫化鈉溶液脫毛，小鼠脫毛面積2 cm×2 cm，注意避免動物皮膚受損，脫毛后以溫水輕輕清洗去毛區(qū)皮膚，24 h 后檢查去毛區(qū)皮膚是否有損傷。分組：選取皮膚脫毛無損傷小鼠80只，雌雄各半，隨機分為對照組、麝香追風(fēng)膏組、樣品一高低劑量組、樣品二高低劑量組和樣品三高低劑量組，每組10 只。麝香追風(fēng)膏劑量為1.72 g 膏·kg-1，樣品一、二、三高劑量為5.28 g 飲片·kg-1、低劑量為1.32 g 飲片·kg-1。給藥：供試品樣品各劑量組及陽性對照藥藥膏使用前置于40 ℃水浴鍋中溫浴加熱，保持40 ℃膏溫，各組去毛區(qū)皮膚小鼠按劑量涂敷給藥，1 次/d，連續(xù)5 d，對照組同法涂敷等重量膏體基質(zhì)。

末次涂敷藥物結(jié)束0.5 h 后，各組小鼠均腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1 mL·10 g-1體重[7]，計時，記錄20 min內(nèi)各組小鼠出現(xiàn)的扭體反應(yīng)次數(shù)，計算抑制率。見表1。

表1 各樣品組對冰醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響（，n=10）

表1 各樣品組對冰醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響（，n=10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與麝香追風(fēng)膏組比較，△P＜0.05

結(jié)果顯示，與對照組比較，麝香追風(fēng)膏組和樣品各劑量組對小鼠扭體潛伏期均明顯延長（P＜0.01），扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；與麝香追風(fēng)膏組比較，樣品各劑量組對小鼠扭體潛伏期、扭體次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；各樣品組間等劑量組之間比較，小鼠扭體潛伏期、扭體次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；考慮到生產(chǎn)的便易性，選擇工藝一為本品的提取工藝，即生姜榨汁，其余飲片加水煎煮提取。

2.2 提取工藝研究 以氯化兩面針堿含量和干膏得率為評價指標(biāo)，采用正交試驗法，對影響提取效果的提取次數(shù)、加水量和提取時間進行優(yōu)選，因素水平分別為：A 提取次數(shù)為1，2，3 次；B 提取時間為1.0，1.5，2.0 h；C 加水倍量為10，12，14 倍。

2.2.1 評價指標(biāo)選擇

2.2.1.1 干膏得率的測定 精密吸取各樣品溶液20 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照干燥失重測定法（《中國藥典》2015 年版4 部通則0831 干燥失重測定法）測定，計算干膏得率。

2.2.1.2 氯化兩面針堿的含量測定 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.02 moL磷酸二氫鉀溶液（磷酸溶液PH5.2）（30:70）為流動相；檢測波長為328 nm，流速為1 mL/min。對照品溶液的配制：精密稱取氯化兩面針堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含45.88 μg 的溶液，即得。供試品溶液的制備：量取提取液適量（相當(dāng)于含兩面針0.3 g），置25 mL 量瓶中，加甲醇15 mL，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。陰性對照溶液的制備：稱取處方中除去兩面針的其余飲片，依法提取制備兩面針陰性對照樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。測定法：分別精密吸取上述各10 μL，注入高效液相色譜儀測定，即得。

2.2.2 樣品的制備 按處方比例，稱取飲片9 份，每份274.5 g，照正交設(shè)計表進行提取，濾液濃縮并定容至250 mL，分別測定干膏得率和氯化兩面針堿的含量。見表2～表3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由直觀分析結(jié)果可見，影響提取效果的因素順序為：（A）＞（B）＞（C），最佳工藝組合為：A3B3C2。方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對提取效果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.10），提取時間和加水倍量對結(jié)果均無顯著影響，綜合考慮生產(chǎn)效率和節(jié)能等因素，確定的優(yōu)選工藝組合，即加水煎煮3 次，每次加10 倍量水，煎煮1 h。

2.2.3 驗證試驗與結(jié)果 按處方比例稱取飲片3 份，每份366 g，分別照擬定的工藝煎煮，濃縮，轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶中，并加水至刻度，搖勻，依次測定，計算。

結(jié)果：3 次驗證試驗的氯化兩面針堿平均含量為45.692 6 μg/g，平均干膏得率為17.95%，平均綜合評分為99.98，與正交試驗最大綜合評分值接近，說明擬定工藝條件合理，可行。

2.3 濃縮工藝考察 取各味飲片1 098 g，照擬定工藝提取，合并提取液，混勻，平均分為2 份，分別進行濃縮工藝考察，其中常壓濃縮和減壓濃縮（60～70℃，-0.06 MPa）各1 份，并分別測定氯化兩面針堿的含量。

結(jié)果顯示，2 種濃縮液中氯化兩面針堿含量分別為29.920 5 μg/g 和29.163 6 μg/g，2 者之間無明顯差異，因此可以選擇常壓濃縮工藝，進行濃縮至相對密度1.25～1.35（60 ℃）。

2.4 成型工藝研究

2.4.1 痹痛凝膠貼劑的制備 將卡波姆均勻散入姜汁水溶液，靜置溶脹12 h；在分別加入適量三乙醇胺、蓖麻油、甘油、甘羥鋁、高嶺土，浸膏，攪拌均勻，涂布，分割，晾干，即得。

2.4.2 凝膠貼劑質(zhì)量評價指標(biāo)及檢測方法

2.4.2.1 初黏力 按照《中國藥典》2015 年版4 部通則0952 黏附力測定法第一法測定[7]，每個樣品平行測定5 次，以測得最大值為100 分，并按照（測得值/最大值）×100 計算初黏力得分。

2.4.2.2 持黏力試驗 按照《中國藥典》2015 年版4部通則0952 黏附力測定法第二法測定[7]，以50 g 的砝碼試驗，記錄試驗開始至滑脫的時間，每個樣品平行測定5 次，以測得最大值為100 分，并按照（測得值/最大值）×100 計算持黏力得分。

2.4.2.3 外觀評價評分標(biāo)準(zhǔn) 按照文獻方法[8]分別對基質(zhì)均勻性、表面光澤度、氣泡狀態(tài)等進行評價，并對各項的綜合得分按權(quán)重求和，以最大值為100 分，并按照（測得值/最大值）×100 計算外觀評價得分。

2.4.3 考察因素及水平 本試驗根據(jù)前期結(jié)果，凝膠貼膏基質(zhì)選用卡波姆為黏合劑，高嶺土為填充劑，甘油為保濕劑，甘羥鋁為交聯(lián)劑。采用均勻?qū)嶒炘O(shè)計法[9]進行凝膠貼膏基質(zhì)處方的篩選，各因素及水平，見表4。

表4 試驗因素與水平

2.4.4 實驗及結(jié)果 選用U13（137）均勻設(shè)計表，分別制備痹痛凝膠貼膏，并測定初黏力和持黏力及外觀評分，見表5。

表5 均勻設(shè)計試驗方案與結(jié)果

2.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 以綜合評分為指標(biāo)，各因素為變量，利用軟件進行逐步回歸分析，得回歸方程：Y=51.284 3-2.6121X7-0.002 1X62-0.238 4X72-0.012 2X1×X6+2.882 8X2×X4+0.681 2X3×X4+0.041 5X3×X6-0.338 7X3×X7+0.017 9X4×X5-0.342 5X4×X7+0.067 4X6×X7，數(shù)據(jù)經(jīng)調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7，F(xiàn)=1 735.308 0，S=0.318 8。此方程經(jīng)F 檢驗具有統(tǒng)計學(xué)意義，方程成立。由該方程可知，制備痹痛凝膠貼膏的制劑最佳配方比例，浸膏干粉:甘羥鋁:卡波姆:高嶺土:甘油:蒸餾水:蓖麻油=7.0:1.5:9.0:3.2:54:180:11.5。

2.4.6 驗證試驗 按照最后優(yōu)選得出的凝膠貼膏基質(zhì)處方制備3 批痹痛凝膠貼膏樣品，結(jié)果3 批樣品的平均綜合評分達96.57，表明該處方配比進行優(yōu)選合理可行。見表6。

表6 驗證試驗結(jié)果

表明該處方配比進行優(yōu)選合理可行，而且按優(yōu)選所得結(jié)果制備的痹痛凝膠貼膏的黏度符合要求，外觀平整光滑，符合外觀評價各項指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)，膏體的保濕度、延展性等各方面均符合標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

由于原處方臨床應(yīng)用為全方粉碎入藥，而當(dāng)前的凝膠貼膏的載藥量有一定的限度，因此在將痹痛膏制備成凝膠貼膏的過程中遇到給藥量較小的問題。由于中藥具有成分多樣，作用機制多靶點的特點，中藥提取可能導(dǎo)致與原處方的藥效的變化。本研究在對處方藥味進行文獻調(diào)研的基礎(chǔ)上，根據(jù)處方中各藥味與本制劑功能主治有關(guān)的有效成分化學(xué)性質(zhì)以及藥理活性作用，擬定不同的提取工藝，基于藥效學(xué)研究開展痹痛凝膠貼膏提取工藝路線篩選，從而保證提取物與原處方藥效一致性，為其進一步研究奠定基礎(chǔ)。

均勻試驗設(shè)計是近年來迅猛發(fā)展的一種嶄新的試驗設(shè)計方法[11]，建筑設(shè)計、工業(yè)生產(chǎn)，它可使試驗點在試驗范圍內(nèi)均勻散布能有效地選擇有代表性的試驗點，以盡可能降低試驗次數(shù)，從而降低成本，提高優(yōu)化篩選的效率，尤其適合醫(yī)藥工藝中多因素、多水平的配方篩選與優(yōu)化[12]。本研究中采用均勻設(shè)計試驗優(yōu)選了痹痛凝膠貼膏的制劑處方配方，驗證結(jié)果顯示，該制劑工藝所得結(jié)果制備的痹痛凝膠貼膏的黏附性良好，外觀平整光滑，外觀評價各項指標(biāo)的良好，可以用于痹痛凝膠貼膏的生產(chǎn)。