茵杞調(diào)脂飲對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟LXRα、CYP7A1 基因表達的影響

王俐鈞，孫建光

（1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250014 ；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南 250014）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）指除過量飲酒外其他因素引發(fā)的肝細胞脂肪變和脂質(zhì)蓄積為特征的病理綜合征，失治、誤治則可能發(fā)展為肝炎、肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制尚未明確，目前普遍認可的是“二次打擊”學說，即肥胖、胰島素抵抗導致糖脂代謝紊亂，進而發(fā)生氧化應激、脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷，細胞因子釋放炎癥介質(zhì)。中醫(yī)認為本病多由飲食不節(jié)、過度肥胖、情志失調(diào)等導致肝失疏泄、脾失健運，腎失氣化，濕熱、痰濁、瘀血叢生，膏脂堆積，阻滯肝絡而成。研究[1]發(fā)現(xiàn)，NAFLD 與肥胖、脂代謝紊亂、高血壓、糖尿病等代謝綜合征相關(guān)。近年來，隨著生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖人口迅速增加，與肥胖相關(guān)的NAFLD 發(fā)生率明顯上升。他汀類藥物如辛伐他汀在降低總膽固醇、三酰甘油方面顯示出良好效果，但因其存在肌肉溶解、肝臟功損害、胃腸道不適等不良反應[2]。茵杞調(diào)脂飲系孫建光教授根據(jù)臨床經(jīng)驗創(chuàng)制，前期研究[3-5]表明其在治療NAFLD 方面有獨特優(yōu)勢，但機制未明。本研究擬通過高脂飲食復制NAFLD 大鼠模型，探討茵杞調(diào)脂飲作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量150～190 g，由濟南朋悅實驗動物中心提供（合格證號：SCXK<魯>2014-0007）。

1.2 藥品及飼料 茵杞調(diào)脂飲方藥組成：茵陳15 g，枸杞15 g，決明子15 g，生山楂15 g，瓜萎15 g，蒼術(shù)12 g，薏米30 g，橘皮9 g，佩蘭葉9 g，小薊15 g，熟大黃3 g，生甘草6 g，由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院煎藥室水提、醇沉濃縮而成；辛伐他汀膠囊購自齊魯制藥有限公司，批號：S14200263233。高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司配置，參照本課題之前研究[6]成果，組成：基礎(chǔ)飼料88%，豬油10%，膽固醇1.4%，膽鹽0.6%。

1.3 檢測試劑 三酰甘油測試盒等由上海茁彩生物科技有限公司提供；總膽固醇測定試劑盒等由南京建成生物工程研究所提供；RT-PCR 試劑盒由美國NEB 公司提供；Trizol 試劑由美國 Promega 公司提供。

1.4 方法

1.4.1 飼養(yǎng)條件 大鼠飼養(yǎng)于山東省千佛山醫(yī)院實驗室，室溫（22±2）℃，濕度（55±5）%，自由飲水和進食。

1.4.2 造模及分組給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后隨機分為6 組，正常組、模型組、茵杞調(diào)脂飲高、中、低劑量組及辛伐他汀陽性對照組，每組8 只。正常組給予普通飼料，余5 組給予高脂飼料。12 周后，正常組與模型組中分別選取1只，進行肝組織病理切片掃描，證實NAFLD 模型建成。茵杞調(diào)脂飲高、中、低劑量組分別按33.12 g/kg、16.56 g/kg、8.28 g/kg 的體質(zhì)量標準灌胃（按成人用藥每日159 g/60 kg 折算），西藥組給予辛伐他汀以2.08 mg/kg 進行灌胃；正常組與模型組給予等量生理鹽水，按1 mL/100 g 體質(zhì)量計算。上述用藥及生理鹽水均1 次/d，治療8 周。每周稱1 次體質(zhì)量，調(diào)整藥量。

1.4.3 標本采集 用藥8 周后，大鼠禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，抽取腹主動脈血5 mL，離心10 min，測肝功、血脂等指標。摘取肝臟，取右葉新鮮組織，浸泡10%福爾馬林固定液中，用于蘇木精-伊紅（HE）染色和油紅O 染色；剩余部分置于于Ep 管中，-80 ℃超低溫冰箱保存，用于檢測肝組織指標。

1.5 檢測方法 血清指標測定：采用全自動生化分析儀檢測，此部分由山東中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)學院檢驗科協(xié)助完成。病理學檢測：福爾馬林浸泡、固定肝臟標本，石蠟包埋、切片，行HE 染色、油紅O 染色，在光鏡下觀察肝組織病變情況、脂肪含量及分布。肝組織指標測定：取肝組織100 mg，制成10%勻漿，離心，取上清液。嚴格按照說明書用RT-PCR 法檢測肝組織LXRα、CYP7A1mRNA 表達。引物序列：GAPDH 上游5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'，138 bp；LXRα 上 游5'-CGAGCTATGCAGTGTATGTGGG-3'，下游5'-ACACTCCTCCCTCATGCCTG-3'，217bp；CYP7A1 上游5'-GGCATCTCAAGCAAACACCAT-3'，下游5'-GCTGTGCGGATATTCAAGGAT-3'，246 bp。擴增條件：95 ℃，15 s，40 個循環(huán)，60 ℃，60 s。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用獨立配對t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗中茵杞調(diào)脂飲低劑量組大鼠死亡1 只，余正常。正常組大鼠體質(zhì)量正常增長，皮毛整齊、光澤，精神狀態(tài)佳，反應靈敏；模型組大鼠體質(zhì)量增長較快，呈腹型肥胖體態(tài)，毛色泛黃、欠光澤，精神欠佳，反應遲鈍；與模型組比較，用藥組大鼠毛色、精神、體力均有所改善。

2.2 各組大鼠血清TG、TC 水平變化比較 見表1。

表1 各組大鼠血清TG、TC 水平變化比較（） mmol/L

表1 各組大鼠血清TG、TC 水平變化比較（） mmol/L

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 各組大鼠血清HDL-C、LDL-C、FFA 測定結(jié)果比較 見表2。

2.4 對大鼠肝臟病理學的影響 HE 染色：空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝竇正常，細胞核大而圓，位于中央，胞質(zhì)均勻，未見脂肪空泡，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇狹窄，細胞核居邊，細胞腫脹，呈氣球樣變，胞內(nèi)可見大小不等的脂滴，大量炎細胞浸潤。各用藥組肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組改善，肝細胞變性、壞死、炎細胞浸潤改善。其中以中藥高劑量組改善最為明顯，肝小葉輪廓略顯清晰，細胞核形態(tài)基本規(guī)則，細胞數(shù)目增多，見圖1。油紅O 染色：正常組肝細胞內(nèi)未見染紅的脂肪沉積。模型組肝細胞內(nèi)見大而圓的紅色脂滴，分布密集，著色較重，部分脂滴連成片狀。各用藥組脂肪染色面積及濃度不同程度減輕，尤以中藥高劑量組和辛伐他汀組變化最為顯著，見圖2。

2.5 對肝組織LXRα、CYP7A1 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織LXRα mRNA 表達明顯升高，CYP7A1 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組大鼠肝組織LXRα 表達降低，CYP7A1 mRNA 表達升高（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，中藥高劑量組LXRα mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。見圖3，圖4 和表3。

表2 各組大鼠血清HDL-C、LDL-C、FFA 測定結(jié)果比較（） mmol/L

表2 各組大鼠血清HDL-C、LDL-C、FFA 測定結(jié)果比較（） mmol/L

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P＜0.05

圖1 茵杞調(diào)脂飲對NAFLD 大鼠肝組織HE 染色的影響（HE，×200）

圖2 茵杞調(diào)脂飲對NAFLD 大鼠肝組織脂肪染色的影響（油紅O，×200）

圖3 各組大鼠肝組織LXRα 表達柱狀圖

圖4 各組大鼠肝組織CYP7A1 mRNA 表達柱狀圖

表3 各組大鼠肝組織LXRα、CYP7A1 mRNA 相對表達量（）

表3 各組大鼠肝組織LXRα、CYP7A1 mRNA 相對表達量（）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P＜0.05

3 討論

茵杞調(diào)脂飲由12 味中藥組成，方中茵陳、枸杞滋腎疏肝，以求治本；決明子、蒼術(shù)、薏米消痰祛濁，山楂、小薊、瓜蔞散滯行瘀，共治其標；加佩蘭、橘皮芳香化濕理脾，大黃導濕熱瘀濁從大便而出，生甘草解毒兼調(diào)和諸藥。諸藥合用，痰熱瘀并治、脾肝腎同調(diào)，契合病機，故能奏效。

膽固醇7a-羥化酶（cholesterol 7-alpha hydroxylase，CYP7A1）屬肝臟特異性微粒體細胞色素P450酶系，是膽汁酸合成代謝經(jīng)典途徑的限速酶，體內(nèi)近50%的膽固醇通過CYP7AI 的催化轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外[7]，其表達水平的高低反映出膽汁酸合成的快慢及機體清除膽固醇的能力。研究[8]發(fā)現(xiàn)給予7 周齡SD雄性大鼠乳酸發(fā)酵豆?jié){5 周，其肝組織CYP7A1mRNA表達較對照組顯著增加（P＜0.001），血清膽固醇水平顯著降低（P＜0.001）。當肝臟發(fā)生損傷時，肝非實質(zhì)細胞如肝巨噬細胞、肝星狀細胞可向肝細胞釋放促炎細胞因子IL-6 等，這些細胞因子正是通過抑制CYP7A1 轉(zhuǎn)錄來抑制膽汁酸合成[9]。

LXRα 被稱為膽固醇的感受器，可被特定的膽固醇氧化衍生物如22（R）-羥化膽固醇、24（S）-羥化膽固醇等激活[10]，參與調(diào)控膽固醇逆轉(zhuǎn)運。LXRα在脂肪的生成、氧化及炎癥因子的產(chǎn)生等多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，因其結(jié)合于不同的靶基因上，可表現(xiàn)為相反的結(jié)果。它既可上調(diào)SREBP-1c、FAS 等基因表達，促進脂肪酸的從頭合成，加重肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積；又可上調(diào)CYP7A1、LPL 等基因表達，調(diào)節(jié)膽固醇代謝平衡，防止脂肪肝的進一步發(fā)展[11]。膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸是體內(nèi)膽固醇的主要清除途徑，研究[12-13]表明當膽固醇及其代謝物在機體中累積，LXRα 被激活，誘導CYP7A1的表達。研究[14]認為中藥復方可抑制NAFLD 動物模型中LXRα 的表達，進而下調(diào)靶基因SREBP-1c、FAS，阻止脂質(zhì)沉積。此外，LXRα 被認為是抗炎因子，可以抑制炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α、MCP-1 等的表達，在炎癥調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[15]。

本實驗中，NAFLD 模型組大鼠病理組織學顯示脂肪變性及大量染紅的脂肪沉積，血清TC、TG、LDL-C、FFA 及肝組織TC、TG、LXRαmRNA 升高，HDL-C、CYP7A1mRNA 表達降低，與正常組比較差異顯著（P＜0.01）。大鼠血清FFA 過多，吸收入肝的脂類增加，肝細胞TC、TG 蓄積，脂質(zhì)代謝紊亂，誘導氧化應激反應引發(fā)肝臟損傷。肝臟的應激作用刺激氧固醇受體LXRα，在一定程度上提高CYP7A1活性[16]，有利于膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持。但長期喂食高脂飲食，大鼠肝內(nèi)膽固醇聚集、內(nèi)源性膽汁酸堆積，對CYP7A1表現(xiàn)出負反饋調(diào)節(jié)，使CYP7A1 表達出現(xiàn)抑制而不是上調(diào)[17-18]，膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸的能力削弱，肝細胞內(nèi)膽汁酸淤積，肝細胞損傷。與此同時，脂肪酸合成過多但氧化不足、載脂蛋白代謝障礙，LXRα 代償性增加，激活相應靶基因，生成大量脂肪酸[19]，引起肝細胞脂肪變性，出現(xiàn)LXRα 和CYP7A1 mRNA 表達出現(xiàn)分離的狀態(tài)。服用不同濃度的茵杞調(diào)脂飲之后，肝組織LXRα mRNA 表達有所降低，CYP7A1 mRNA 表達有所升高，結(jié)合血脂、肝脂指標的改善，說明在藥物的調(diào)治作用下，LXRα、CYP7A1 mRNA 表達水平逐漸恢復，二者的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系重新趨于正常，激活下游與膽固醇和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因，降低脂代謝相關(guān)蛋白酶活性，LDL-C 降低，體內(nèi)運輸至肝臟的膽固醇減少[20]，HDL-C 升高，將肝臟中的磷脂和膽固醇轉(zhuǎn)運出去，阻止脂質(zhì)的沉積,抑制線粒體功能紊亂及胰島素抵抗而對肝臟起保護作用，肝細胞得以修復，TC、TG 水平幾近正常。

綜上所述，茵杞調(diào)脂飲通過調(diào)節(jié)LXRα、CYP7A1 mRNA 表達，可調(diào)控體內(nèi)脂肪合成，改善血脂、肝脂及肝組織病理變化，緩解NAFLD 進展。茵杞調(diào)脂飲具有中醫(yī)調(diào)理的特色和優(yōu)勢，可整體治療、標本兼治，臨床療效優(yōu)于單純降脂藥物，該藥應用安全性高，具有較好的應用前景。但其具體作用機制仍需進一步研究。