補腎活血方防治阿爾茨海默病的機制研究

劉盼興，王 旭

（遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合基礎醫(yī)學院，沈陽 110032）

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease,AD）又名老年性癡呆，是危害人類健康的一種嚴重的神經退行性疾病，臨床上主要表現為認知、記憶、智力、日常生活能力等方面的退化及改變[1]。該病病因復雜，醫(yī)家對其病因病機進行研究探索中認為腎虛髓虧、瘀血阻絡為該病的主要病因病機。從而，通過補腎活血法治療AD 成為中醫(yī)界的探究熱點[2]。2009 年－2011 年期間，我院王恩龍教授[3]觀察補腎活血中藥對40 例老年性癡呆患者的臨床療效，發(fā)現補腎活血中藥可以改善老年性癡呆患者的認知能力，提高患者的生活質量，但其中的作用機制卻不甚了解。Iba1蛋白是小膠質細胞中的鈣結合蛋白，該抗體已被廣泛用作小膠質細胞的標記物；GFAP 蛋白是星形膠質細胞膠質絲的主要成分，該抗體是星形膠質細胞的標志性蛋白[4]，它們二者是促炎因子和氧化應激的重要來源，可分泌大量的促炎因子[5-6]，而炎性因子的增加，導致海馬介導的認知功能破壞[7]，在中樞神經系統(tǒng)的炎癥反應中發(fā)揮著至關重要的作用。所以我們采用水迷宮實驗、免疫組化實驗及Western blot 實驗來探究補腎活血方治療AD 的機制是否與其可以抑制炎癥反應相關。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 將24 只7 月齡的SPF 級的SAMP8雄性鼠隨機分為3 組，分別為模型組、鹽酸多奈哌齊西藥組和補腎活血方中藥組，另外將8 只7 月齡的SPF 級的SAMR1 鼠作為正常對照組。造模時正常組和模型組小鼠按體質量給予生理鹽水灌胃，西藥組給予鹽酸多奈哌齊灌胃，灌胃劑量為3 mg/（kg·d），中藥組給予補腎活血方進行灌胃6 g/（kg·d），灌胃時間為4 周。

1.2 實驗器材及實驗動物灌胃藥物的制備 檢測試劑與儀器：兔多克隆GFAP 抗體（Abcam，美國），兔多克隆Iba1 抗體（Abcam，美國），β-actin 抗體（sigma，美國），組織蛋白裂解液、BCA 工作液等（碧云天生物技術有限公司）。Mirror 水迷宮自動實驗記錄儀，BIO-RAD 凝膠圖像分析系統(tǒng)，電泳儀，電泳槽，濕轉轉膜槽，脫色搖床，Leica 石蠟切片機，超速冷凍離心機，Olympus 光學顯微鏡，電子天平，微波爐，恒溫水浴箱。補腎活血方藥物組成：丹參 20 g，川芎20 g，山藥 15 g，熟地黃10 g，鹿角膠 10 g，枸杞子15 g，牛膝 15 g，菟絲子10 g，山茱萸 10 g。用藥物總體積的4 倍量水浸泡2 h，沸后改文火煎，煎煮1 h 后倒出藥液；繼用藥物體積2 倍量水，再煎2 次，合并3 次藥液。濾過，濾液用文火濃縮至流浸膏，水浴繼續(xù)濃縮至稠浸膏，真空干燥（80 ℃）得干浸膏。將干浸膏無菌條件裝瓶，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸多奈哌齊的制備：將鹽酸多奈哌齊片（成人劑量為5 mg/d）置于純凈水中，經超聲細胞粉碎機制成濃度為4 mg/mL 的混懸液，藥物配制后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前搖勻。

1.3 Morris 水迷宮實驗 灌胃28 d 后進行水迷宮適應訓練，首先練習站臺，可將小鼠放于平臺上1 min，然后開始入水訓練，每只小鼠訓練2 次，從不同象限入水，1 min/次，如果找不到站臺，應予以引導至站臺，停留1 min。定位航行試驗為期5 d，平臺置于第三象限中心，小鼠分別于上午和下午各進行1 次試驗，每次試驗時間1 min，第一象限池壁的中點作為入水點，但放置平臺的第三象限不作為入水點，上午和下午的入水順序相同。如果大鼠在1 min 內未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，讓其在平臺上停留1 min，再放回籠內。以小鼠入水后到找到平臺的游泳時間即逃避潛伏期做為觀測指標，60 s 內未找到平臺的記為60 s?？臻g探索試驗于定位航行結束后次日上午撤除平臺，在原平臺象限的對側象限即第一象限入水，記錄的游泳軌跡，測量內小鼠在原平臺象限停留時間并進行比較。數據搜集和處理由軟件完成。

1.4 動物取材 待小鼠Morris 水迷宮實驗結束后，將4 組小鼠置于乙醚罐中進行麻醉，待鼠深度麻醉后行斷頭處死，在冰盒內剝離小鼠的大腦，從中間矢狀縫切開，將小鼠的大腦左半球置于4%多聚甲醛溶液中，進行固定，脫水、透明、浸蠟后常規(guī)制備石蠟切片，供免疫組織化學染色使用；小鼠大腦右半球仔細分離出海馬和皮層，置于-80℃進行深度冰凍，供western blot 實驗備用。

1.5 免疫組化實驗 將鼠的大腦左半球制成石蠟切片后，進行免疫組化實驗。將石蠟切片于烤箱內烤片1 h 后，進行脫蠟操作，然后PBS 液沖洗，之后檸檬酸緩沖液中微波修復，再次PBS 液沖洗后行山羊血清封閉0.5 h，滴加一抗，4℃過夜，PBS 液沖洗后再滴加二抗，PBS 沖洗后滴加三抗，PBS 沖洗，然后進行DAB 顯色、核復染、脫水等操作，最后用中性樹膠封片觀察。

1.6 Western blot 實驗 將鼠右腦的海馬組織進行勻漿后行Western blot 實驗。首先配膠，按照各比例備好膠板后，將其置于電泳槽中進行加樣、預電泳和電泳操作，電泳完成后進行轉印2 h，結束后棄膠，將膜取下置于麗春紅染液后進行裁膜，然后用TBST 液洗膜，洗膜后開始滴加一抗，牛奶封閉，4℃過夜，再次用TBST 液洗膜，然后滴加二抗，再次用TBST液洗膜，最后進行曝光觀察，圖像采集及數據分析均由軟件完成。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件建立數據庫，并以均數±標準差（）表示各定量指標的平均值和分散程度。多樣本均數的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 及Dunnett’sT 3 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 定位航行實驗各組小鼠潛伏期用時比較 見表1。

表1 定位航行實驗各組小鼠潛伏期用時比較（）s

表1 定位航行實驗各組小鼠潛伏期用時比較（）s

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

2.2 補腎活血方對各組小鼠大腦海馬區(qū)Iba1 表達的影響 免疫組化的結果顯示，正常組SAMR1 鼠大腦海馬CA1 區(qū)神經細胞形態(tài)完整，排列有序，無明顯Iba1 陽性染色；與正常組SAMR1 小鼠比較，模型組SAMP8 鼠陽性細胞染色加深，Iba1 陽性細胞數量增多，對陽性細胞所占比例進行統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組SAMP8 小鼠比較，中藥組與西藥組SAMP8 鼠的陽性細胞染色淺，Iba1 陽性細胞數量有不同程度減少，對陽性細胞所占比例統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1、圖2）。采用western blot 法檢測各組小鼠大腦海馬內Iba1 蛋白（圖3）。統(tǒng)計結果分析顯示，與正常組SAMR1 小鼠比較，模型組SAMP8 小鼠Iba1 蛋白含量明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經中藥與西藥處理后，與模型組小鼠比較，Iba1 蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組小鼠比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）（圖4）。

圖1 免疫組化法檢測各組小鼠大腦海馬CA1 區(qū)Iba1 的分布（scale bar=20 μm）

圖2 各組小鼠大腦海馬CA1 區(qū)Iba1 染色陽性細胞數量所占比例的差異比較

2.3 補腎活血方對各組小鼠大腦海馬區(qū)GFAP 表達的影響 采用免疫組化法觀察各組小鼠大腦海馬區(qū)GFAP 的分布與表達，結果顯示：正常組SAMR1 鼠大腦海馬CA1 區(qū)無明顯GFAP 陽性染色細胞；與正常組SAMR1 小鼠比較，模型組SAMP8 鼠陽性細胞胞體增大，突起增粗增長，染色加深，呈棕黃色，GFAP 陽性染色細胞數量增多，其陽性細胞所占比例差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組SAMP8小鼠比較，中藥組與西藥組SAMP8 鼠的陽性染色細胞多呈不規(guī)則、扁平的多角形狀，胞體及突起角纖細，染色淺，數量有不同程度減少，陽性細胞所占比例差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖5、圖6）。采用western blot 實驗方法來檢測各組小鼠大腦海馬內GFAP蛋白（圖7），統(tǒng)計結果分析顯示，與正常鼠比較，模型組小鼠GFAP 蛋白含量明顯較高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經中藥與西藥處理后，與模型組小鼠比較，中藥組與西藥組小鼠大腦海馬內GFAP蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組小鼠比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）（圖8）。

圖3 western blot 檢測各組小鼠海馬內Iba1 蛋白水平的表達比較

圖4 各組小鼠大腦海馬內Iba1 蛋白的相對值比較

圖5 免疫組化法檢測各組小鼠大腦海馬CA1 區(qū)GFAP 的分布（scale bar=20 μm）

圖6 各組小鼠海馬CA1 區(qū)GFAP 染色陽性細胞數量所占比例的差異比較

圖7 western blot 檢測各組小鼠海馬GFAP 蛋白水平的表達比較

圖8 各組小鼠大腦海馬內GFAP 蛋白的相對值比較

3 討論

阿爾茨海默病（alzheimer’s disease,AD）是一種與增齡相關的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病[8]。在中醫(yī)學中一直認為“腎藏精生髓通腦”，腎與腦功能的關系密切。AD 的臨床表現多與腦功能的缺失有關，但從臟腑理論中追其溯源，其發(fā)病之根本在于腎。各醫(yī)家對AD病因病機的研究探討大多從虛、實兩端入手[9]。許多醫(yī)家[10-12]認為腎虛髓虧、瘀血阻絡為AD 形成的基本病機[13]。

在本次研究中發(fā)現，水迷宮實驗中，與模型組SAMP8 鼠相比，正常對照組鼠在第3 天的逃避潛伏期明顯縮短，說明正常組鼠經過2 天的實驗適應，對水迷宮的內部環(huán)境更為熟悉，符合實驗對正常組的要求。與模型組SAMP8 鼠相比，中藥組和西藥組SAMP8 鼠在第三天的逃避潛伏期亦縮短，而模型組鼠的逃避潛伏期卻無明顯變化，說明經過實驗訓練學習，中藥組與西藥組鼠能比模型組鼠更早的適應水迷宮的內部環(huán)境，較模型組鼠有更強的學習能力。另外，與模型組SAMP8 鼠相比，中藥組、西藥組的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），說明中藥組與西藥組SAMP8 鼠在西藥與補腎活血方的治療后，憑借水迷宮實驗獲取的記憶能力，能在更短的時間內找到并登上平臺。免疫組化實驗中，由GFAP 抗體與Iba1 抗體標記的星形膠質細胞與小膠質細胞在正常組SAMR1 鼠的海馬CA1 區(qū)少有表達；與正常組SAMR1 小鼠相比，模型組小鼠海馬CA1 區(qū)的兩種染色陽性細胞有更為明顯的表達，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），該兩種陽性細胞胞體增大，突起增粗增長，染色加深，呈棕黃色；而與模型組小鼠相比，中藥組與西藥組小鼠海馬CA1 區(qū)星形膠質細胞與小膠質細胞數量明顯較少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且該兩種陽性細胞多呈不規(guī)則、扁平的多角形形狀，胞體及突起角纖細，染色淺；在Western blot 實驗中發(fā)現，與模型組小鼠相比，中藥組與西藥組小鼠的Iba1 與GFAP 蛋白含量均明顯較少，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而中藥組與西藥組小鼠兩種蛋白含量相比，差異沒有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。通過免疫組化實驗與Western blot實驗可以得知補腎活血方可以抑制小膠質細胞與星形膠質細胞的過度表達，從而阻礙了該兩種膠質細胞介導的慢性炎癥反應，保護了機體的中樞神經系統(tǒng)，臨床上對AD 有一定的治療作用。

經理論研究及實驗探索結果表明，補腎活血方可以通過間接抑制中樞神經系統(tǒng)的慢性炎癥反應發(fā)生以改善SAMP8 小鼠的學習認知及記憶能力，保護機體神經系統(tǒng)的正常功能運行，從而對AD 起到治療作用。但僅依靠免疫組化實驗與Western blot實驗得到的結果，無法探究補腎活血方除可以通過抑制神經系統(tǒng)內慢性炎癥反應的發(fā)生這一機制治療AD 之外，是否還有其他的作用機制，為解決這一問題，仍需我們進行更多更深一步的實驗研究與探索。