基于大生產(chǎn)考察燙制對(duì)骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量的影響*

馬 杰，丁 野，羅 艷，李瑞蓮，王湘波△

（1．湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410001； 2．湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410001）

燙骨碎補(bǔ)是骨碎補(bǔ)的炮制品，由水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J．Sm．的干燥根莖經(jīng)凈制或切制后照燙法用砂燙至鼓起，再撞去毛而得。其功效為療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨，筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)；外用消風(fēng)祛斑，用于跌撲閃挫，外治斑禿、白癜風(fēng)［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，骨碎補(bǔ)功效作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為總黃酮［2-3］。經(jīng)砂燙后，骨碎補(bǔ)質(zhì)地酥脆，有利于有效成分的提?。?］。柚皮苷作為骨碎補(bǔ)中總黃酮的代表性成分，文獻(xiàn)對(duì)其含量受燙制的影響程度報(bào)道不一，如有研究認(rèn)為炮制后其柚皮苷含量變化不大［5］，但也有研究表明砂燙后柚皮苷含量降低［6］。以上研究對(duì)骨碎補(bǔ)的炮制均在實(shí)驗(yàn)室中完成，但目前市售燙骨碎補(bǔ)飲片由中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，在炮制過程中設(shè)備、規(guī)模及工藝參數(shù)均與實(shí)驗(yàn)室存在差異。為全面、客觀地考察燙制對(duì)骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量變化的影響，本研究中開展了2個(gè)方面的研究：一是與中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)合作，實(shí)地參與骨碎補(bǔ)的砂燙炮制，考察不同溫度、炮制時(shí)長對(duì)柚皮苷含量的影響；二是收集不同中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)的多批次骨碎補(bǔ)藥材及相對(duì)應(yīng)的燙骨碎補(bǔ)飲片產(chǎn)品中柚皮苷的數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Mettler AE-200型電子天平（萬分之一），Mettler CP-225D型電子天平（十萬分之一），德國梅特勒公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；CY-700型滾筒式燃油炒藥機(jī)（杭州市富陽方正制藥設(shè)備廠）；CTDC900型電磁炒藥機(jī)。

試藥：柚皮苷對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)為110722-201714，純度為93．4%）由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

樣品：從不同飲片生產(chǎn)企業(yè)收集10批骨碎補(bǔ)藥材（序號(hào)為Y1～Y10）和其對(duì)應(yīng)生產(chǎn)的批燙骨碎補(bǔ)飲片，以及現(xiàn)場(chǎng)炮制骨碎補(bǔ)藥材2批（序號(hào)為Y11～Y12），所有樣品均經(jīng)湖南省藥品檢驗(yàn)研究院主任藥師丁野鑒定為水龍骨科植物槲蕨的干燥根Drynaria fortunei（Kunze）J．Sm．。樣品信息詳見表1。

表1 骨碎補(bǔ)藥材樣品及對(duì)應(yīng)燙骨碎補(bǔ)信息表

2 方法與結(jié)果

2．1 樣品炮制

在炒藥筒內(nèi)加入河砂（粒徑5～8 mm）及少量植物油，加熱并開啟滾筒，待溫度升至設(shè)定值后，取骨碎補(bǔ)藥材適量加至滾筒中翻炒，并隨時(shí)觀察骨碎補(bǔ)形態(tài)，當(dāng)全部骨碎補(bǔ)炒至鼓起后，出料，篩去河砂后攤涼，再撞去毛，即得。電磁炒藥機(jī)設(shè)置加熱溫度為280℃，約6 min可炒好；燃油炒藥機(jī)設(shè)置加熱溫度為300℃，約2 min可炒好。

為考察燙制時(shí)長的影響，電磁式加熱炒藥機(jī)于加料后的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 min時(shí)分別取部分樣品待測(cè)；燃油式加熱炒藥機(jī)于加料后的0．5，1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0，4．5，5．0，5．5，6．0，7．0 min時(shí)分別取部分樣品待測(cè)。

為考察燙制溫度的影響，取同一批骨碎補(bǔ)藥材（批號(hào)為20190202，產(chǎn)地為貴州施秉），分別在電磁式加熱炒藥機(jī)設(shè)置加熱溫度為140，200，240，280，320，360℃下砂燙，以炒至全部鼓起為準(zhǔn)，出料，篩去河砂后攤涼，再撞去毛，即得。

2．2 溶液制備

供試品溶液［7-9］：取本品粗粉約0．25 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置50 mL容量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液：稱取柚皮苷對(duì)照品23．83 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液（445．144 4μg／mL）。精密吸取對(duì)照品貯備液，加甲醇依次稀釋成質(zhì)量濃度為89．028 8，17．805 7，3．561 1，0．712 2μg／mL的對(duì)照品溶液。

2．3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Capcell Pak C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-2%冰醋酸水溶液（35∶65）；流速：1．0 mL／min；檢測(cè)波長：283 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按柚皮苷計(jì)不低于3 000。

圖1 高效液相色譜圖

2．4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取質(zhì)量濃度為445．144 4，89．028 8，17．805 7，3．561 1，0．712 2μg／mL的對(duì)照品溶液5μL或10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以進(jìn)樣量為（X，ng）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝1 862．3X＋7 156．3，r＝0．999 9。結(jié)果表明，柚皮苷進(jìn)樣量在3．561 2～2 226 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一燙骨碎補(bǔ)（批號(hào)為180603）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD為0．59%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一燙骨碎補(bǔ)（批號(hào)為180603）供試品溶液，分別于配制后的0，3，6，12，24 h時(shí)精密吸取5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD為0．61%（n＝5），表明供試品溶液在配制后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一燙骨碎補(bǔ)樣品（批號(hào)為180603），依法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果為7．91 mg／g，RSD為0．78%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已測(cè)定含量的同一燙骨碎補(bǔ)（批號(hào)為180603，含柚皮苷7．913 mg／g）供試品約0．125 g共9份，精密稱定，置錐形瓶中，按80%，100%，120%的水平精密加入質(zhì)量濃度為476．6μg／mL的柚皮苷對(duì)照品溶液適量，依法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算。結(jié)果見表2。

2．5 樣品含量測(cè)定

取各批樣品粉碎，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，測(cè)定柚皮苷峰面積積分值，按外標(biāo)法計(jì)算柚皮苷的百分含量（按干燥品計(jì)）。結(jié)果見表3、表4和圖2。

表3 燙骨碎補(bǔ)與骨碎補(bǔ)藥材柚皮苷含量變化（%）

表4 燙制溫度對(duì)柚皮苷含量的影響

3 討論

圖2 燙制時(shí)長對(duì)柚皮苷含量的影響

電磁式炒藥機(jī)和燃油式炒藥機(jī)的加熱方式不同，電磁式更易把握加熱速率和控制加熱時(shí)間，不會(huì)在很短時(shí)間內(nèi)將樣品炒焦。但二者對(duì)柚皮苷含量的影響相似，隨著炮制時(shí)間的增加，柚皮苷的含量逐漸降低。使用電磁式炒藥機(jī)燙制，6 min即可炒至全鼓起，柚皮苷含量降至炒前的69．6%，12 min后樣品被炒焦，柚皮苷含量逐漸降至最低。使用燃油式炒藥機(jī)燙制，2 min即可炒至全鼓起，柚皮苷含量降至炒前的80．4%，7 min便將樣品炒焦，柚皮苷含量逐漸降至最低。

不同燙制溫度對(duì)燙制后骨碎補(bǔ)的含量影響結(jié)果表明，不同燙制溫度對(duì)柚皮苷含量水平的影響程度不同，電磁炒藥機(jī)設(shè)置為240℃、燃油炒藥機(jī)設(shè)置為220℃可使柚皮苷損失最少，2家生產(chǎn)企業(yè)設(shè)置的加熱溫度和時(shí)間并未讓柚皮苷含量得到最大程度的保留。

扣除水分的影響，以干燥品計(jì)，收集的10批次燙骨碎補(bǔ)與燙制前相比，柚皮苷含量明顯升高的有4批，明顯降低的有2批，未見明顯變化的有4批，變化率范圍從20．29%～151．98%，不同批次間的含量變化情況迥異，與本試驗(yàn)中考察的柚皮苷含量均降低的結(jié)果不吻合。一方面不同生產(chǎn)企業(yè)燙骨碎補(bǔ)柚皮苷的變化率差異較大，可能由于中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)之間不同的砂燙工藝參數(shù)對(duì)柚皮苷的含量造成了不同程度的影響；另一方面，部分生產(chǎn)企業(yè)的柚皮苷含量變化趨勢(shì)也存在較大差異，表明在生產(chǎn)企業(yè)燙制時(shí)工藝參數(shù)不穩(wěn)定。因此，有必要繼續(xù)擴(kuò)大生產(chǎn)企業(yè)、炮制方法等考察范圍，以更加全面、準(zhǔn)確、客觀地評(píng)價(jià)柚皮苷的含量變化規(guī)律。

在燙制骨碎補(bǔ)時(shí)，使用的是現(xiàn)代化的加熱設(shè)備，燙制溫度可設(shè)定為固定數(shù)值，而燙制時(shí)長即燙制終點(diǎn)仍需操作人員憑經(jīng)驗(yàn)時(shí)刻觀察骨碎補(bǔ)的鼓起情況來判斷。在實(shí)際考察中發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)藥材的規(guī)格均一性對(duì)燙制時(shí)長有較大影響：藥材大小、粗細(xì)越接近，所有骨碎補(bǔ)藥材均燙至鼓起的時(shí)間越相當(dāng)，燙制時(shí)長就相對(duì)較固定；藥材大小、粗細(xì)差異較大，則在燙制時(shí)，細(xì)小和粗大的鼓起時(shí)間差異較大，造成當(dāng)粗大的燙至鼓起時(shí)，細(xì)小的已錯(cuò)過了最佳出料時(shí)間，從而降低了柚皮苷的含量。因此，建議在生產(chǎn)燙骨碎補(bǔ)時(shí)，使用大小、粗細(xì)等規(guī)格較接近或經(jīng)均勻切制后的骨碎補(bǔ)藥材作為原料。

為研究骨碎補(bǔ)毛（鱗片）的保留情況對(duì)柚皮苷含量的影響程度，試驗(yàn)還考察了燙制前后骨碎補(bǔ)毛（鱗片）中柚皮苷的含量，結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)毛（鱗片）中柚皮苷含量為根莖主體的10%左右，燙制后柚皮苷略有上升。因其質(zhì)量占比較低，故骨碎補(bǔ)毛的保留程度對(duì)骨碎補(bǔ)砂燙后造成的影響可忽略不計(jì)。