酪蛋白磷酸肽的酶水解條件研究

軒詩海1 張鐵濤2

（1 黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司 2 瓊州學(xué)院化學(xué)系）

近年來，生物活性肽作為保健食品市場的新生力量顯示出了強(qiáng)大的市場潛力。乳源性生物活性肽是生物活性肽中最重要的一類，乳源性生物活性肽的種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的有阿片肽、免疫促進(jìn)肽、阿片拮抗肽、抗高血壓肽、抗血栓肽、酪蛋白磷酸肽和其它一些生物活性肽［1,2］，其中酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPPs）是發(fā)現(xiàn)較早的一種，酪蛋白磷酸肽是蛋白酶水解酪蛋白后形成的一種含成簇磷酸絲氨酸基團(tuán)的生物活性短肽，因其具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，特別是鈣質(zhì)吸收等多種生物活性而倍受關(guān)注。本研究主要是以粗制的干酪素為原料，采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定堿性蛋白酶水解干酪素制備酪蛋白磷酸肽的最佳工藝條件［3,4,5］。

1 材料與方法

1.1 原料與主要試劑

本試驗(yàn)所用的原料是甘肅華羚乳品集團(tuán)公司工業(yè)精一級(jí)干酪素，顏色呈淡黃色，其主要成分見表1-1，其它化學(xué)試劑均為分析純。

?

1.2 堿性蛋白酶水解干酪素制備CPPs單因素試驗(yàn)

為了確定正交試驗(yàn)各因素的水平范圍，以水解度為指標(biāo)，對(duì)影響蛋白酶水解的[E]/[S]、pH、溫度和時(shí)間做單因素分析。

1.2.1 [E]/[S]對(duì)水解度影響

固定底物濃度為15%，pH為9.0，溫度為50℃，水解時(shí)間為2.0 h。選取[E]/[S]為 400 u/g～2000 u/g（相差為400 u/g），對(duì)底物進(jìn)行水解。

1.2.2 pH對(duì)水解度影響

固定底物濃度為15%，[E]/[S]為800 u/g，溫度為50℃，水解時(shí)間為2.0 h。選取pH為9.0～11.0（相差為0.5），對(duì)底物進(jìn)行水解。

1.2.3 溫度對(duì)水解度的影響

固定底物濃度為15%，[E]/[S]為800 u/g，pH為9.0，水解時(shí)間為2.0 h。選取溫度為40℃～60℃（相差為5℃），對(duì)底物進(jìn)行水解。

1.2.4 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

固定底物濃度為15%，[E]/[S]為800 u/g，pH為9.0，溫度為50℃。選取水解時(shí)間為1.0 h～3.0 h（相差為0.5 h），對(duì)底物進(jìn)行水解。

1.3 最佳水解條件的選擇

根據(jù)單因素試驗(yàn)，固定底物濃度為15%，按表1-2設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)方案，在不同[E]/[S]、水解溫度、反應(yīng)pH和水解時(shí)間的條件下對(duì)底物進(jìn)行水解，根據(jù)CPPs的N/P來確定最佳水解條件。到達(dá)預(yù)定反應(yīng)時(shí)間后，立即將反應(yīng)器置于沸水浴中5 min，以終止水解反應(yīng)。

?

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性蛋白酶水解干酪素制備CPPs單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 [E]/[S]對(duì)水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、溫度50℃、pH 9.0、時(shí)間2.0 h，[E]/[S]分別為400 u/g、800 u/g、1200 u/g、1600 u/g、2000 u/g。以不同[E]/[S]為橫坐標(biāo)，所消耗的0.1mol/LNaOH的體積為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖2-1。

從圖2-1看出，隨著[E]/[S]的升高，水解度也不斷增大，但是當(dāng)酶濃度達(dá)到一定的數(shù)值時(shí)，水解度不再升高，而是趨于平緩，也就是說底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)已達(dá)到飽和，即使增加酶量也沒有底物與之結(jié)合。

2.1.2 pH對(duì)水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、[E]/[S]800 u/g、溫度50℃、時(shí)間2.0 h，pH分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。以pH為橫坐標(biāo)，所消耗的0.1mol/LNaOH的體積為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖2-2。

從圖2-2看出，pH小于10時(shí)，水解度隨pH增大而不斷增大，pH大于10時(shí)，水解度隨pH增大而不斷減少，在pH等于10，水解度最大，說明其最適pH為10。

2.1.3 溫度對(duì)水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、[E]/[S]800u/g、pH 9.0、時(shí)間2.0 h，水解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。以水解溫度為橫坐標(biāo)，所消耗的0.1mol/LNaOH的體積為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖2-3。

從圖2-3看出，隨著水解溫度的升高，水解度也增加，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度不再升高并趨于平緩，也就是說將反應(yīng)溫度維持在55℃～60℃，酶活力能保持最高值。

2.1.4 時(shí)間對(duì)水解度影響

用堿性蛋白酶水解酪蛋白溶液，水解條件為底物濃度15%、[E]/[S]800u/g、溫度50℃、pH 9.0，水解時(shí)間分別為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h。以水解時(shí)間為橫坐標(biāo)，所消耗NaOH的體積為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖2-4。

從圖2-4可看出，隨著水解時(shí)間的增加，水解度持續(xù)增加，當(dāng)水解2.5 h后，水解度不再升高并趨于平緩，這時(shí)候酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解減緩，酶活力下降，這時(shí)應(yīng)終止水解反應(yīng)。

從單因素的實(shí)驗(yàn)中我們可以看出，對(duì)堿性蛋白酶來說，最有利于它進(jìn)行水解的條件為[E]/[S]為1200 u/g、pH 10、溫度55℃、水解時(shí)間為2.5 h。

2.2 堿性蛋白酶制備CPPs最佳條件的確定

做為CPPs產(chǎn)品優(yōu)劣的評(píng)定指標(biāo)，N/P摩爾比比較客觀地反映出磷酸絲氨酸基團(tuán)在多肽中的密度，其值越小，磷酸絲氨酸基團(tuán)的密度越大，肽鏈越短，產(chǎn)品純度越高，其結(jié)合礦物質(zhì)離子的能力就越強(qiáng)。以N/P值為指標(biāo)，用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳水解條件，試驗(yàn)結(jié)果見表2-1，結(jié)果分析見表2-1。

從表2-1可以看出各因素對(duì)N/P摩爾比影響的大小順序?yàn)椋築>D>A>C。最終確定水解條件的最優(yōu)組合為A3B1C3D1，即最佳反應(yīng)條件為：溫度55℃、pH9.0、時(shí)間2.5h、酶濃度800u/g。經(jīng)驗(yàn)證性試驗(yàn)得出，在此條件下得到的CPPs的N/P比為4.371，產(chǎn)率為12.88%。

?

3 結(jié)論

由單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果及四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定用堿性蛋白酶從水解的原料—劣質(zhì)干酪素中提取酪蛋白的最佳反應(yīng)條件是溫度55℃、pH 9.0、時(shí)間4.0 h、原料濃度為15%。由方差分析可知，選定的四個(gè)因素在其相應(yīng)的水平范圍內(nèi)對(duì)試驗(yàn)的影響都不太大，因此在原則上，試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)這四個(gè)因素只需控制在其相應(yīng)的水平范圍內(nèi)即可。

[1] 蔡為榮, 薛正蓮.生物活性肽－酪蛋白磷酸肽（CPP）的研制[J].食品科學(xué), 2001, 22(4):52～54

[2] 馮杰龍, 林煒鐵, 徐曉飛, 姚汝華.生物活性肽及其蛋白酶水解法制備探索[J].廣州食品工業(yè)科技, 2002, 18(3):36～38

[3] 陳慶森, 龐廣昌, 林康藝, 胡志和, 劉劍虹, 閻亞麗.固定化堿性蛋白酶生產(chǎn)CPP的研究[J].食品科學(xué), 2000, 21(1):25～28

[4] 劉劍虹, 龐廣昌, 于金華, 張曉玲, 陳慶森, 胡志和.酪蛋白磷酸肽(CPPs)的純化研究[J].食品科學(xué), 2001, 22(4):31～35

[5] 龐廣昌, 胡志和, 陳慶森, 劉劍虹.利用2709堿性蛋白酶水解酪蛋白制備CPPs的研究[J].食品科學(xué), 2000,21(12):34～35