高效液相色譜泵出口單向閥功能的新性能測試

Eduard ROGATSKY, Matthew GALLITTO, Daniel T.STEIN

單向閥對于高效液相色譜(HPLC)泵硬件來說是一個重要的機械部件。在參考文獻[1]中對單向閥的功能和硬件設(shè)計進行了詳細描述。簡單來說，就是一對單向閥(入口和出口)阻止流體在HPLC泵頭里從高壓區(qū)流向低壓區(qū)，從而泵的活塞在高壓下使流動相通過色譜柱。“一個功能適宜的單向閥必須能夠快速方便地打開和關(guān)閉，同時還要確保密閉性在一個寬的壓力值范圍內(nèi)均有效[1]”。

根據(jù)定義，HPLC泵上的單向閥是在高壓下承受重復(fù)的機械壓力，因此這個設(shè)備比HPLC泵的其他部件(例如活塞或活塞密封圈)更易出現(xiàn)故障。但在單向閥出現(xiàn)故障時卻很難識別，雖然HPLC可以通過泵壓力下降準確地檢測不同種類的外部泄漏，然而遺憾的是泵內(nèi)部連接的漏液卻是比較復(fù)雜的，因為此時不會有一個明顯的壓力下降，所以HPLC軟件程序中的診斷算法也無法識別。

已有人在運行高通量的多維液相色譜時發(fā)現(xiàn)了這個問題[2]。他們觀察到在這個應(yīng)用程序中，被分析物的保留時間非常慢但是平穩(wěn)增加大約10%；然而硬件診斷測試卻能成功通過。這種現(xiàn)象不能解釋為色譜柱的損壞，而且正如所預(yù)料的那樣換色譜柱是無益的。這個問題需要通過替換安捷倫1100二元HPLC泵(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)B泵頭(提供有機溶劑)上的出口單向閥才能解決。值得注意的是，替換A泵頭的單向閥不會影響保留時間(數(shù)據(jù)沒有列出)。

Agilent 1100系列二元泵G1312A由兩個一模一樣的溶劑傳輸通道(泵頭)組成。每個泵頭使用兩個活塞來輸送溶劑，即入口和出口單向閥(圖1)。為了找出可能的泵故障，壓力測試(PT)和漏液測試(LT)可作為ChemStation軟件(Agilent)的一部分。壓力測試僅使用A通道使壓力增加到390 bar，然后泵流速關(guān)閉。預(yù)期的壓降應(yīng)該不超過2 bar/min。這種測試能有效地評估外部泄漏；然而內(nèi)部泄漏可能仍舊存在并且很難發(fā)現(xiàn)。例如，對12個已使用過的出口單向閥進行試驗研究，其中一些雖能成功通過壓力測試，但是不能通過漏液測試，漏液測試對內(nèi)泄漏評估更有效。在這個測試中，每個活塞以3 μL/min速度傳輸30 s，所得到的壓力曲線應(yīng)是水平的(穩(wěn)定水平)或是極小正數(shù)，換句話說，如果壓力出現(xiàn)負的斜率，測試就失敗了，意味著所輸送的異丙醇100%的損失。壓力曲線是水平的而不是降低的內(nèi)漏是ChemStation診斷方法/算法認為可接受的內(nèi)漏。當(dāng)溶劑傳輸時在活塞1的沖擊下通過一個發(fā)生故障的入口單向閥部分回流到溶液存儲器中，此時就會發(fā)生內(nèi)漏?；蛘?，溶液在活塞2的沖擊下通過發(fā)生故障的出口單向閥部分回流到室1。當(dāng)活塞2傳輸溶劑時，充滿大氣壓的室1會發(fā)生從高壓到低壓的回流。內(nèi)漏影響泵頭傳輸?shù)膶嶋H流速，它比軟件預(yù)調(diào)的值少。流量計可以測出泵流量，理論上，在安裝流速限制器(例如毛細管) 之后，精確流量計可以檢測出微小的內(nèi)泄露。然而，一個液體流量計價格昂貴，且很難保證同步性，在分析實驗室里很少使用。因此檢測內(nèi)泄漏極具挑戰(zhàn)性。

如上所述，增加的保留時間可以用來解釋流動相在泵頭B(傳輸有機相)的內(nèi)泄漏。這樣的泄漏從傳輸泵頭室2到計量泵頭室1都可能發(fā)生。如果出口單向閥的球座壞了也可能發(fā)生回流。因此越少的有機溶劑通過泵傳輸?shù)缴V柱，保留時間就越長。保留時間增加的另外一種可能是通過一個沒有完全關(guān)閉的入口單向閥從室1漏液。理論上，如果泵頭A的機械耐用性比泵頭B高(導(dǎo)致更多的內(nèi)漏)，這樣的循環(huán)將會減少被分析物的保留時間。這種漂移，可能會錯誤的解釋為是色譜柱損壞造成的結(jié)果。

一般的HPLC診斷測試無法診斷出微量的內(nèi)漏液，所以研發(fā)出一系列的性能測試，以期設(shè)計出解決潛在的單向閥溶液傳輸問題故障的方法。實驗是在Agilent 1100系列二元泵G1312A和紫外檢測器G1314A上完成的。

我們建議以下的方法。在泵維護或修理后，在相同流量下，使用水作為流動相A和水/0.1%丙酮作為流動相B運行30 min的梯度，更換一根色譜柱，安裝上背壓閥。作者使用1.5 mX65 μm i.d.的PEEK管(p#1560,IDEX/Upchurch, Oak Harbor, WA)作為一個零死體積的流量限制器，這種管子在0.5 mL/min時產(chǎn)生250 bar的壓力。然后，達到最大吸收信號一半時的保留時間可以通過254 nm波長的紫外曲線計算出來[3]。通過減去梯度前的平衡時間和二分之一的程序設(shè)定梯度時間（半梯度時間），我們就可以得到最大信號一半時的延遲時間和半梯度時間[3]，并且可以計算出流量所允許的延遲體積V50的倍增系數(shù)。理想的二元泵(沒有死體積，同時A、B兩通道操作完全相同)的V50的值與半梯度體積相同。換句話說，在到達半梯度時間點時，通道傳輸相同的流量和紫外信號最大值的一半是可以預(yù)計的。

當(dāng)泵有確定的死體積時，到達最大信號半值的時間會發(fā)生延遲。如果A通道內(nèi)泄漏，則會使A通道傳輸更少的流動相，導(dǎo)致最大信號半值更早發(fā)生，V50的值將減少(梯度比預(yù)料的稍微更陡)。在B通道微小的漏液將導(dǎo)致最大信號半值延遲，V50的值將變大。比較前后所獲得的紫外曲線，即使呈現(xiàn)不同梯度也可能并不是漏液的問題，而是 B的預(yù)處理 (在溶劑中丙酮的百分含量)不精確或紫外燈效能降低所導(dǎo)致的。

相比之下，無論信號最大值如何變化，V50的值是不變的。當(dāng)V50的值確定后，在當(dāng)前硬件配置中，它可以作為一個給定的泵(梯度識別) 的參比值。值得注意的是，這個值與壓力、溫度和硬件都有關(guān)。如果在V50中和之前的測量對比存在5%的偏差，但是診斷測試完全成功，作者則建議交換AB出口單向閥并重復(fù)測試。再次強調(diào)，V50的增加意味著B通道漏液，減低說明A通道漏液。轉(zhuǎn)換出口閥后重新檢查梯度運行，最新得到的V50值增加說明出口單向閥有故障，如果V50值仍然不變，說明在以上懷疑的通道中入口閥出現(xiàn)故障。

因為搭建的診斷測試不能識別微泄漏，所以嚴格控制V50的值對確保快速硬件診斷與維修而言就顯得尤為重要。被分析物保留時間的漂移可以很明確地指出與這個硬件相關(guān)的漏液情況。在40~60 min的梯度(常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析)實驗中，我們應(yīng)該評價每個溶液傳輸通道性能，用以排除硬件對保留時間不穩(wěn)定的影響。如果V50值先前未確定或不能進行常規(guī)監(jiān)控,那么診斷和維修會更為復(fù)雜和冗長。因此,使用高壓液體流量計對于系統(tǒng)性能控制而言，可能是快速的但卻花費昂貴的選擇。

[1] Dolan J.Check valve problems.LC·GC North Amer, 2006,24: 132 - 8.

[2] Rogatsky E, Braaten K, Cruikshank G, Jayatillake H, Zheng B, Stein D T.Flow inconsistency: the evil twin of column switching - hardware aspects.J Chromatogr A, 2009, 1216:7721 - 7.

[3] Dolan J.Dwell volume revisited.LC ·GC North Amer, 2006,24: 458 - 66.