脊髓活性氧激活自噬參與調(diào)節(jié)2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛*

陳佳麗 張茂表 陸嘉輝 賈改麗 李 軍 曹 紅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科；溫州醫(yī)科大學(xué)疼痛醫(yī)學(xué)研究所，溫州 325027）

糖尿病是一種常見的慢性疾病，全球有超過4.25億成人患病，約90%的糖尿病病人是2型糖尿病[1]，而糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，大約1/3以上的糖尿病人會(huì)并發(fā)DNP，嚴(yán)重影響病人的正常生活，且現(xiàn)有藥物治療效果不佳[2]。臨床上主要表現(xiàn)為自發(fā)痛、感覺異常、痛覺過敏以及異常性疼痛[3]，然而其病理生理機(jī)制尚未闡明。近年研究表明，長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致的神經(jīng)受損異常放電、交感神經(jīng)激活和氧化應(yīng)激性代謝紊亂是DNP的主要發(fā)病機(jī)制[4]?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)是一系列具有高度活性的氧自由基的總稱，研究發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)病理性疼痛和炎性疼痛在內(nèi)的持續(xù)性疼痛與ROS的過度表達(dá)有關(guān)[5]。自噬是一種溶酶體依賴性的自我消化過程，回收利用損傷或功能不足的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，比如受損的線粒體[6]。在神經(jīng)病理性疼痛模型中，脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中自噬活動(dòng)都有明顯改變，自噬在慢性疼痛中起到重要作用[7]。而研究表明ROS作為信號(hào)分子參與自噬的調(diào)節(jié)[8]，但ROS與自噬在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)我們擬觀察ROS對(duì)脊髓自噬的影響，探討脊髓ROS介導(dǎo)自噬與大鼠2型DNP的關(guān)系。本研究將首次闡明DNP中兩種重要致病因素ROS與自噬之間的關(guān)系，為臨床上治療DNP提供可行的新思路。

方 法

1.主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素 (streptozocin, STZ)，N-叔丁基-α-苯基硝酮(N-tert-Butyl-α-phenylnitrone, PBN)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)均購(gòu)自Sigma；ROS檢測(cè)盒購(gòu)自南京建成生物公司；Beclin 1抗體、LC3和p62抗體均購(gòu)自Abcam；β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；2390型Electronic von Frey觸覺測(cè)痛儀及II Tc336型甩尾足底測(cè)試儀購(gòu)自IITC；電泳轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad；熒光顯微鏡購(gòu)自Leica。

2.動(dòng)物模型制備及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠，120～150 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h晝夜交替，溫度23℃～25℃，自由攝食攝水的環(huán)境中。適應(yīng)環(huán)境3 d后，將其隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組（C組，n= 10）和高脂高糖喂養(yǎng)組（DA組，n= 80），正常對(duì)照組始終給予正常飼料喂養(yǎng)，高脂高糖組喂養(yǎng)高脂高糖飼料（67%普通飼料+ 10%豬油+ 20%蔗糖+ 2%膽固醇+ 1%膽酸鈉）喂養(yǎng)8周誘導(dǎo)胰島素抵抗，于第0周、第8周分別測(cè)體重、血糖，并在第8周時(shí)取大鼠尾靜脈血用ELISA法測(cè)血清胰島素水平，計(jì)算胰島素敏感性（ISI, 1÷空腹血糖×血清胰島素）。測(cè)量第8周時(shí)大鼠的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)，設(shè)為基礎(chǔ)值。高脂高糖喂養(yǎng)8周后，大鼠誘導(dǎo)出胰島素抵抗，禁食不禁飲12 h，腹腔單次注射STZ (35 mg/kg)。3 d后測(cè)量大鼠尾靜脈血糖，血糖穩(wěn)定且≥16.7 mmol/L為2型糖尿病制備成功，14 d后測(cè)量大鼠痛閾值，MWT和TWL均下降至基礎(chǔ)值的85%以下為2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛組，而MWT和TWL均高于85%基礎(chǔ)值的歸為2型糖尿病不痛組（PL組）。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將2型DNP大鼠分為3組：DNP組，DNP + PBN組（DNP +ROS清除劑組），SC組（溶劑對(duì)照組），每組10只。PBN的給藥方式為腹腔注射，100 mg/kg，溶解于DMSO，在STZ注射14 d，模型制備成功后，每天1次，連續(xù)給藥14 d，DNP組不做任何處理，SC組給予同體積的DMSO。

3.方法

（1）ELISA—胰島素和胰島素敏感指數(shù)測(cè)量：在喂養(yǎng)8周后，禁食不禁飲12 h后，取正常對(duì)照組和高脂高糖組大鼠尾靜脈血，用ELISA測(cè)試盒檢測(cè)大鼠胰島素濃度，并通過計(jì)算公式（1÷空腹血糖×血清胰島素）計(jì)算得出胰島素敏感指數(shù)，此計(jì)算所得數(shù)值為非正態(tài)分布，故采用其自然對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

（2）行為學(xué)測(cè)定：喂養(yǎng)8周后測(cè)量大鼠的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值和熱縮足反應(yīng)，設(shè)為其基礎(chǔ)值，在STZ注射14 d后和給藥3、7、14 d后分別測(cè)量大鼠的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值和熱縮足反應(yīng)。

機(jī)械縮足反應(yīng)閾值的測(cè)定：將大鼠置于金屬絲網(wǎng)底籠(22 cm×22 cm×22 cm)中并適應(yīng)30 min，玻璃箱被置于高于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面50 cm。用IITC 2390型Electronic von Frey觸覺測(cè)痛儀垂直刺激后爪的足底表面，單次刺激時(shí)間≤1 s，刺激間隔10 s。記錄大鼠抬起其后爪的刺激強(qiáng)度，測(cè)量5次，每次間隔5 min，并將平均值用作MWT。

熱縮足潛伏期的測(cè)定：將大鼠置于透明的方形有機(jī)玻璃盒（3 mm厚，20 cm×15 cm×30 cm）中并適應(yīng)30 min。將后爪的中心暴露于由IITC 336型足底/甩尾測(cè)試儀設(shè)定的熱刺激。動(dòng)物的反應(yīng)時(shí)間從輻射熱測(cè)量開始直到大鼠縮足或舔足并記錄為TWL，雙足各測(cè)定5次，每次間隔5 min，并將平均值用作TWL。

（3）標(biāo)本取材和處理：給藥后第3 d、7 d、14 d取各組大鼠L4-L6脊髓腰膨大，并放入超低溫冰箱中備用于Western blot實(shí)驗(yàn)。另取5只大鼠麻醉后經(jīng)心臟灌注先生理鹽水后4%多聚甲醛，取L4-L6脊髓腰膨大，固定脫水后用OCT包埋，切片，用作免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

（4）Western blot：將組織標(biāo)本按重量體積比1:10加入裂解液，充分研磨，超聲離心后取上清液，后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照30 μg、10 μl每孔上樣，經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上，10%脫脂牛奶常溫?fù)u床2 h，以封閉非特異性蛋白位點(diǎn)，再分別加入Beclin 1抗 體 (1:2 000)、LC3抗體 (1:1 000)、p62抗體(1:20 000)和β-actin抗體(1:3 000)中，4℃孵育過夜，次日取出條帶用TBST洗膜3次，每次10 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG抗體，室溫下孵育2 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，ECL曝光。條帶采用Quantity One進(jìn)行分析，以目的蛋白/β-actin的灰度值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

（5）免疫熒光染色使用冰凍切片機(jī)將已灌注包埋好的組織切成6 μm厚的切片，室溫下復(fù)溫30 min，PBS洗片3次，每次10 min，隨后在室溫下用含0.2%Triton X-100的PBS溶液滲透30 min，用免疫熒光封閉液（碧云天）37℃下封閉15 min，再分別加入Beclin 1抗體(1:200)、NeuN抗體(1:200)、IBA抗體(1:200)、GFAP抗體(1:200)，4℃過夜，次日用PBS洗片（如前），加入熒光標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h后PBS洗片（同前），DAPI染核，封片，熒光顯微鏡觀看組織形態(tài)。

（6）ROS含量檢測(cè)：根據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒說明操作，測(cè)量脊髓腰膨大中的ROS含量。熒光探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)用于檢測(cè)ROS，其自身非熒光，在ROS的存在下被氧化成發(fā)熒光的DCF。取100 mg脊髓腰膨大組織，用機(jī)械法制備成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，加入10 μM DCFH-DA 37℃孵育30 min，用PBS洗滌后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量，通過CytExpert分析軟件統(tǒng)計(jì)處理。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(D)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠體重、血糖、胰島素敏感指數(shù)的變化情況

與正常對(duì)照組（C組）比較，高脂高糖組（DA組）大鼠的體重在第8周時(shí)明顯升高(P< 0.05)，注射STZ 14 d后體重下降明顯(P< 0.05)，而空腹血糖在第8周時(shí)無(wú)明顯變化，注射STZ 3 d后血糖明顯升高（P< 0.05，見表1）。第8周時(shí)，高脂高糖組（DA組）大鼠的胰島素水平較正常對(duì)照組（C組）明顯升高(P< 0.05)，胰島素敏感指數(shù)下降(P< 0.05)，產(chǎn)生胰島素抵抗（見表2）。

2.各組大鼠MWT和TWL的變化

與C組比較，PL組大鼠MWT和TWL均無(wú)明顯改變，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而DNP組和SC組與C組比較，MWT明顯降低(P< 0.05)，TWL縮短(P< 0.05)；當(dāng)腹腔內(nèi)注射ROS清除劑PBN后，與DNP組比較，DNP + PBN組在給藥后第3 d、7 d、14 d MWT升高(P< 0.05)，TWL明顯延長(zhǎng)(P< 0.05)。DNP組和SC組兩組之間MWT和TWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。在注射STZ 17 d、21 d、28 d后DNP組中ROS含量明顯升高(P< 0.05)，說明2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的ROS相關(guān)氧化應(yīng)激活性增強(qiáng) （見圖2）。

表1 C組和DA組體重、血糖的比較 (n = 10,D)Table 1 Comparison of weight and blood glucose between group C and group DA (n = 10,D)

表1 C組和DA組體重、血糖的比較 (n = 10,D)Table 1 Comparison of weight and blood glucose between group C and group DA (n = 10,D)

*P < 0.05，與C組比較，compared with group C.

體重Weight (g) 血糖Blood glucose (mmol/L)0 week 8 weeks 14 d after STZ 0 week 8 weeks 3 d after STZ C 138±7 365±10 434±18 3.5±0.4 3.6±0.5 4.4±0.7 DA 134±11 427±23* 320±26* 3.7±0.9 4.0±0.7 29.3±3.8*組別Group

表2 C組和DA組胰島素水平、胰島素敏感指數(shù)的比較 (n = 10,D)Table 2 Comparison of insulin levels and insulin sensitivity index (ISI) between group C and group DA (n = 10,D)

表2 C組和DA組胰島素水平、胰島素敏感指數(shù)的比較 (n = 10,D)Table 2 Comparison of insulin levels and insulin sensitivity index (ISI) between group C and group DA (n = 10,D)

*P < 0.05，與C組比較，compared with group C.

胰島素水平Insulin levels (mU/L) 胰島素敏感指數(shù)ISI 0 week 8 weeks 0 week 8 weeks C 16.5±1.4 16.9±2.3 -4.13±0.29 -4.38±0.21 DA 16.8±0.8 46.1±5.0* -4.19±0.18 -7.21±0.22*組別Group

圖1 各組大鼠MWT和TWL的變化 (n = 10,D)Fig.1 Changes of MWT and TWL in each group of rats (n = 10,D)

3.DNP中發(fā)生的自噬可被PBN抑制

DNP大鼠給予PBN后第3 d、7 d、14 d，Western blot檢測(cè)脊髓腰膨大中的蛋白表達(dá)量，與C組比較，PL組的脊髓中Beclin 1和p62表達(dá)無(wú)明顯改變，而LC3-II表達(dá)上調(diào)(P< 0.05)，說明自噬體合成增加；與PL組比較，DNP組和SC組的脊髓中LC3-II和Beclin 1表達(dá)均明顯上調(diào)(P< 0.05)，而p62表達(dá)量明顯下降(P< 0.05)，說明DNP組大鼠脊髓自噬功能激活；與DNP組比較，使用了ROS清除劑PBN后，脊髓中的LC3-II和Beclin 1表達(dá)均明顯下降(P< 0.05)，而p62表達(dá)量升高(P< 0.05)；DNP組和SC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3）。免疫熒光染色顯示在脊髓背角中自噬的標(biāo)記蛋白Beclin 1主要與小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白(IBA)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白(GFAP)共定位，表明自噬可能主要發(fā)生在脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中（見圖4）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠脊髓中ROS的含量 (n = 4,D)Fig.2 The production of ROS in spinal cord detected by flow cytometry (n = 4,D)

討 論

活性氧(ROS)作為一部分正常細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的具有活性的含氧化合物，主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ROS的主要來(lái)源是線粒體內(nèi)膜中的電子傳遞鏈，在生理狀態(tài)下的低濃度ROS對(duì)于機(jī)體防御功能是必要的，但過量的ROS會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸氧化[9]。既往研究表明，ROS參與多種疾病的病理生理過程，包括哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默病等，近期研究顯示ROS在各種疼痛疾病模型中起著關(guān)鍵性作用，包括炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛。使用ROS清除劑如PBN[10]、維生素E[11]、Tempol[12]等，可以有效緩解神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的疼痛行為。本研究結(jié)果表明，與正常大鼠或糖尿病無(wú)痛大鼠比較，在造模成功后第3 d、7 d、14 d 糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中ROS含量明顯增加，使用ROS清除劑PBN后，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的疼痛行為顯著緩解，提示脊髓中ROS含量增加參與了2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生維持的機(jī)制。

自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體系統(tǒng)降解自身成分的一種高度保守的分解代謝途徑，在多種應(yīng)激狀態(tài)下，對(duì)于清除氧化或受損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)以及維持新陳代謝和分子合成具有非常重要的作用[13]。文獻(xiàn)報(bào)道自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可以產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程的鎮(zhèn)痛和抗炎效果，且激活自噬可以促進(jìn)神經(jīng)再生和髓鞘形成，防止慢性疼痛的形成，而自噬阻滯劑3-MA會(huì)使神經(jīng)病理性疼痛得到明顯的加重和延長(zhǎng)[7]。研究證明，活性氧的產(chǎn)生、低氧刺激、病毒感染等可刺激自噬的發(fā)生，而ROS可以通過Atg4、過氧化物酶、線粒體電子傳遞鏈(mETC)等不同機(jī)制來(lái)誘發(fā)自噬[8,14,15]。

LC3（微管相關(guān)蛋白-3）是經(jīng)典的自噬指標(biāo)，以LC3 I和LC3 II兩種形式存在，其中LC3 I是非活化形式，主要存在于胞質(zhì)中；LC3 II一直定位于自噬體膜上直至被溶酶體酶降解，因此是目前反映細(xì)胞內(nèi)自噬水平的特異性標(biāo)記蛋白[16]。Beclin 1是自噬相關(guān)蛋白之一，在自噬泡起始合成步驟中起關(guān)鍵作用，并且是BECN1/VPS34/VPS15復(fù)合物（也稱為PI3KC III）的組分[17]。由于自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，因此自噬小體的增加并不能說明自噬的水平，還需要檢測(cè)自噬降解水平的標(biāo)記物p62。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自噬降解水平增加，p62減少[18]。觀察各組大鼠自噬標(biāo)記物的表達(dá)量變化，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DNP組大鼠Beclin 1、LC3 II/LC3 I蛋白含量增加，p62表達(dá)量減少，說明自噬功能增強(qiáng)，而使用ROS清除劑后，自噬功能減弱，行為學(xué)分析上DNP組在使用PBN后MWT明顯升高，TWL延長(zhǎng)。這說明過多的ROS可以通過激活自噬來(lái)清除氧化的蛋白和損傷的細(xì)胞器從而利于細(xì)胞存活。由此我們可以得出一個(gè)結(jié)論，即在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中，ROS過多是導(dǎo)致DNP發(fā)生的原因，而過多的ROS會(huì)激活自噬，自噬是一種保護(hù)機(jī)制。本文首次闡明了2型DNP中ROS與自噬之間的關(guān)系，然而自噬在本模型中具體的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步研究。

圖3 Western blot法檢測(cè)大鼠脊髓中LC3-I, LC3-II, Beclin 1和p62的表達(dá) (n = 4,D)Fig.3 The expression of LC3-I, LC3-II, Beclin 1 and p62 in spinal cord by Western blot (n = 4D)

綜上所述，在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中脊髓ROS增多后激活自噬，這有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

圖4 免疫熒光染色顯示Beclin 1主要定位于脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞上 Scale bar = 50 μmFig.4 Immunofluorescence staining showed that the major Beclin 1 (red) co-localizes with microglia (IBA, green) and astrocyte(GFAP, green).Scale bar = 50 μm