Toll樣受體家族介導(dǎo)疼痛和癢覺信號的分子機(jī)制*

張 麗 白占濤 王志紅 高永靜 劉 通

（1江蘇大學(xué)附屬昆山市第一人民醫(yī)院麻醉科，昆山215300；2延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，延安716000；3蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，蘇州215123；4南通大學(xué)疼痛醫(yī)學(xué)研究院，特種醫(yī)學(xué)研究院，南通226019）

眾所周知，疼痛和瘙癢是機(jī)體兩種截然不同的主觀感覺，但兩者又彼此密切聯(lián)系。國際疼痛研究會將疼痛定義為“一種與實際或潛在的組織損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗”[1]。目前，瘙癢的一般定義為“一種誘發(fā)抓撓欲望或反射的不愉快的軀體感覺”[2]。疼痛和瘙癢所誘發(fā)的均為軀體不愉快的主觀感覺體驗，但是疼痛引起的是退縮反射，而瘙癢引起的是抓撓反應(yīng)[3]。疼痛可以發(fā)生在機(jī)體除大腦以外的深部和淺表幾乎所有器官組織，而瘙癢僅發(fā)生在皮膚和粘膜等淺表組織處。在急性條件下，疼痛和瘙癢的感覺都可以作為警告信號，保護(hù)機(jī)體免受可能的傷害性刺激造成的損傷。急性瘙癢可以通過抓撓[4]和疼痛刺激得到緩解；而嗎啡等止痛劑則常常引起機(jī)體的瘙癢感覺[5]。

在慢性疾病的條件下，不論是疼痛還是瘙癢的癥狀，都成為一種對機(jī)體無益且難以適應(yīng)性的疾病狀態(tài)，嚴(yán)重影響病人的睡眠和生活質(zhì)量。有趣的是，在慢性疼痛的病理條件下，瘙癢刺激可以誘發(fā)疼痛感覺；而在慢性瘙癢的病理條件下，疼痛刺激也可以引起瘙癢感覺[6]。特別是在慢性病理條件下，瘙癢和疼痛的病理機(jī)制有著許多相似之處[6]。慢性疼痛和慢性瘙癢的臨床癥狀也有許多相似之處。對慢性疼痛來言，包括外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛、外周組織損傷或炎癥誘導(dǎo)的炎癥性疼痛、功能障礙性疼痛、以及腫瘤引起的癌癥痛等；其臨床表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏（指對閾上疼痛刺激的反應(yīng)性增強(qiáng)）、觸誘發(fā)痛（無害的輕觸刺激誘發(fā)疼痛）[1]。慢性瘙癢可以在多種疾病狀態(tài)下發(fā)生，包括如銀屑病等皮膚疾病、膽汁淤積等肝臟疾病、慢性腎病、糖尿病等代謝性疾病以及帶狀皰疹病毒感染等，其臨床表現(xiàn)為自發(fā)性瘙癢、癢覺過敏、觸誘發(fā)癢（無害的輕觸刺激誘發(fā)瘙癢）等[2]。

一、疼痛和瘙癢的神經(jīng)傳導(dǎo)通路

外周組織中瘙癢和疼痛的信號均可由初級感覺神經(jīng)元游離的外周神經(jīng)末梢（主要是Aδ和C類纖維）所探測。初級感覺神經(jīng)元屬于假單極神經(jīng)元，其胞體位于背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和三叉神經(jīng)節(jié)(TG)[2]。初級感覺神經(jīng)元發(fā)出的中樞軸突末梢投射到脊髓（或延髓）背角區(qū)域，在這里進(jìn)行瘙癢和疼痛的信號的第一級中樞的加工處理。初級感覺神經(jīng)元中負(fù)責(zé)感受疼痛刺激的細(xì)胞亞群（即傷害性感受器；Nociceptor）中有一小部分專門負(fù)責(zé)感受瘙癢刺激，也稱為癢感受器(Pruriceptor)。初級感覺神經(jīng)元上表達(dá)多種類型的感受疼痛或瘙癢刺激的受體，包括G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、瞬時感受器電位離子通道（TRP通道）、酸敏感通道(ASICs)、細(xì)胞因子受體（如白細(xì)胞介素1β受體等）以及機(jī)械敏感離子通道（如PIEZO通道等）。其中，有些受體只感受疼痛刺激，如某些GPCRs、細(xì)胞因子或趨化因子受體等。有些受體既能感受疼痛也感受瘙癢，如組胺受體、蛋白酶激活受體（PARs）、五羥色胺(5-HT)受體某些亞型和緩激肽受體等。還有一些受體僅能感受瘙癢刺激，包括G蛋白偶聯(lián)受體MrgprA3、5-HT7受體和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)受體等[2]。此外，初級感覺神經(jīng)元進(jìn)行疼痛和瘙癢的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，也通常采用相互重疊的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如瞬時受體電位受體家族TRPV1、TRPV4和TRPA1通道等[7]。

位于脊髓的第二級投射神經(jīng)元通過上行傳導(dǎo)通路投射到腦干和丘腦，通過第三級神經(jīng)元進(jìn)一步投射到大腦皮層等相關(guān)區(qū)域，最終形成包含情緒、認(rèn)知等多維度的痛覺感知。從腦干到脊髓的下行投射的5-HT能和去甲腎上腺素能神經(jīng)纖維，通過激活脊髓局部環(huán)路的抑制性中間神經(jīng)元[如γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸]，從而抑制疼痛信號的傳導(dǎo)。關(guān)于癢覺的上行傳導(dǎo)通路研究不多，一般認(rèn)為跟痛覺的傳導(dǎo)通路大致重合。近來的研究發(fā)現(xiàn)，臂旁核(parabrachial nucleus, PBN)是作為癢覺上行傳導(dǎo)通路上的重要的中繼核團(tuán)[8]。此外，在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray, PAG)，GABA能神經(jīng)元的激活或谷氨酸能神經(jīng)元的抑制均對瘙癢產(chǎn)生下行抑制的作用，而GABA能神經(jīng)元還能編碼癢覺的厭惡情緒[9,10]。最近的研究表明，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area, VTA)中的多巴胺能神經(jīng)元的激活介導(dǎo)抓撓誘導(dǎo)的愉快感，而GABA能神經(jīng)元的激活則介導(dǎo)癢覺誘導(dǎo)的厭惡情緒[11]。

慢性疼痛和慢性瘙癢的發(fā)病機(jī)制有許多相似之處，都包括外周初級感覺神經(jīng)元的敏感性增強(qiáng)（稱為外周敏化）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的適應(yīng)不良和敏感性增強(qiáng)（稱為中樞敏化）[12]。例如，觸誘發(fā)痛和觸誘發(fā)癢是慢性疼痛和慢性瘙癢下的兩種常見現(xiàn)象，而中樞敏化機(jī)制在其發(fā)病中均發(fā)揮重要作用[6]。在臨床上，加巴噴丁和普瑞巴林等藥物對慢性疼痛和慢性瘙癢均有較好的緩解作用[3]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，前腦GABA能神經(jīng)元的脊髓移植對神經(jīng)病理性疼痛[13]和神經(jīng)病理性瘙癢產(chǎn)生了抑制作用[14]，這一結(jié)果為脊髓抑制性突觸傳遞喪失（即去抑制作用）在慢性疼痛和慢性瘙癢中的關(guān)鍵作用提供了重要的實驗證據(jù)。

二、神經(jīng)免疫互作信號參與疼痛和瘙癢信號的發(fā)生和加工

外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)穩(wěn)態(tài)的維持需要神經(jīng)元和非神經(jīng)元的免疫細(xì)胞之間的雙向交流[15]。然而，這種神經(jīng)免疫的相互作用在病理條件下會發(fā)生功能障礙，參與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理發(fā)生，包括中風(fēng)、多發(fā)性硬化癥(MS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和慢性疼痛[15]。機(jī)體在發(fā)生感染或組織損傷后，位于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種非神經(jīng)細(xì)胞類型，包括免疫細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、癌細(xì)胞和入侵的細(xì)菌等，釋放神經(jīng)活性物質(zhì)直接激活、敏化或沉默傷害性感受器或癢感受器，從而促進(jìn)或抑制疼痛或瘙癢信號的產(chǎn)生[16]。雖然疼痛或瘙癢信號產(chǎn)生的分子機(jī)制可能不同，這個通用模型可作為一個有用的范式來描述各種非神經(jīng)細(xì)胞類型以及疼痛或瘙癢介質(zhì)的生物學(xué)功能。

Toll樣受體(TLR)位于神經(jīng)免疫系統(tǒng)的界面，并且神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的TLRs激活后，通過直接地激活初級感覺神經(jīng)元或促使非神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子或趨化因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)疼痛和瘙癢的信號加工過程[17]。本文重點討論TLRs在調(diào)節(jié)疼痛和瘙癢信號中的新作用，并討論了靶向TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能作為緩解慢性疼痛和慢性瘙癢的新策略。

三、Toll樣受體家族及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

第一個被確定的TLR家族成員是果蠅的Toll分子。Toll對果蠅胚胎發(fā)育過程中的背腹模式以及抗真菌先天免疫反應(yīng)至關(guān)重要[18]。哺乳動物的Toll樣受體(TLR)隨后被克隆，并被證明屬于模式識別受體(PRRs)，其通過直接識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和危險相關(guān)的分子模式(DAMPs)來啟動先天免疫應(yīng)答反應(yīng)。免疫細(xì)胞中的TLRs參與會啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子的合成和釋放[18]。TLRs介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答也被認(rèn)為是產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的先決條件。

迄今，已在人類和嚙齒動物中鑒定出13種功能性TLRs[18]。TLRs是進(jìn)化上保守的I型跨膜蛋白，并且包含介導(dǎo)配體識別的、富含亮氨酸重復(fù)序列的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和激活下游信號傳導(dǎo)的TIR結(jié)構(gòu)域。根據(jù)它們的亞細(xì)胞定位，TLRs可分為細(xì)胞膜TLR (TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR10)和內(nèi)體TLR (TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)。然而，根據(jù)細(xì)胞類型不同，一些內(nèi)體TLRs（例如TLR7）也可以定位于細(xì)胞膜上（見表1）。 大多數(shù)類型的TLR在它們之間形成同源二聚體，而某些TLR則形成異二聚體，例如TLR1/TLR2和TLR2/TLR6。

TLRs檢測來自微生物的不同PAMPs，包括病毒、細(xì)菌、分枝桿菌、真菌和寄生蟲等[18]。對于細(xì)胞膜表達(dá)的TLRs，TLR1、TLR2和TLR6能夠檢測脂蛋白，TLR4能夠檢測脂多糖(LPS)，TLR5負(fù)責(zé)檢測鞭毛蛋白等。內(nèi)體TLRs負(fù)責(zé)感知核酸，例如TLR3感知雙鏈(ds) RNA，TLR7和TLR8感知單鏈(ss) RNA，TLR9感知CpG DNA。在病理條件下，TLRs可通過識別細(xì)胞壞死和組織損傷后釋放的內(nèi)源性DAMPs，來誘導(dǎo)無菌炎癥反應(yīng)[19]。TLRs的激活通過募集嗜中性粒細(xì)胞和激活巨噬細(xì)胞以及干擾素(IFN)刺激的基因表達(dá)，來清除侵入體內(nèi)的病原體。此外，TLRs的激活還能導(dǎo)致樹突細(xì)胞(DC)的成熟，這對于適應(yīng)性免疫應(yīng)答至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)接分子MyD88是大多數(shù)TLRs的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需，但TLR3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則不需要MyD88[18]（見圖1）。TLR2和TLR4也通過轉(zhuǎn)接分子TIRAP轉(zhuǎn)導(dǎo)信號（見圖1）。TLRs識別配體后，MyD88募集IL-1R相關(guān)激酶(IRAK)。IRAK活化導(dǎo)致與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TRAF6)的相互作用，并導(dǎo)致NFκB (IκB)-激酶復(fù)合物（IKK復(fù)合物）的磷酸化。IκB的磷酸化導(dǎo)致IκB的降解，從而允許NFκB易位至細(xì)胞核并啟動隨后的基因轉(zhuǎn)錄。同時，TRAF6激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38和c-Jun N末端激酶(JNK)，并啟動基因轉(zhuǎn)錄。TLRs信號通路的激活產(chǎn)生許多促炎細(xì)胞因子或趨化因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IL-8 和 MIP2 等，以及活性氧或活性氮（見圖1）。TLR3和TLR4利用轉(zhuǎn)接分子TRIF，最終激活NFκB和干擾素調(diào)節(jié)因子3 (IRF3)[18]。TRIF招募TRAF6用于NFκB的活化，類似于MyD88依賴性信號途徑。TRIF信號傳導(dǎo)導(dǎo)致IRF3的磷酸化及其核轉(zhuǎn)位。IRF3的激活又導(dǎo)致I型干擾素(IFN)的轉(zhuǎn)錄。

表1 Toll樣受體家族概況、亞細(xì)胞定位、配體、銜接蛋白與疼痛或瘙癢

四、Toll樣受體家族與疼痛

越來越多的證據(jù)表明，TLRs介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與慢性疼痛發(fā)病的外周敏化和中樞敏化機(jī)制有關(guān)。TLRs恰好位于神經(jīng)免疫系統(tǒng)的界面，并且在外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的多種細(xì)胞類型中表達(dá)[20]。為人們所熟知的是，非神經(jīng)元細(xì)胞的TLRs的活化產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶。近來最新的研究表明，在初級感覺神經(jīng)元中，神經(jīng)元TLRs的激活通過開放離子通道，并啟動動作電位或使對致痛源和致癢源的神經(jīng)元反應(yīng)的敏感性增加。本部分綜述了各種不同的TLR家族成員的功能及其在疼痛中的重要作用。

1.TLR2和疼痛

TLR2通過形成TLR2-TLR1和TLR2-TLR6異二聚體來區(qū)分識別多種脂肽。有證據(jù)支持一些DAMPs，例如HMGB1、HSP60、雙糖鏈蛋白聚糖和透明質(zhì)酸等，也可以被TLR2識別，盡管這些DAMPs并非僅由TLR2識別[21]。TLR2激活后通過轉(zhuǎn)接分子MyD88依賴性途徑啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。與腦中的其他細(xì)胞類型相比，TLR2的表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞中高度富集，表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TLR2主要在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)[22]。還有證據(jù)表明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和初級感覺神經(jīng)元中，也檢測到TLR2的低水平表達(dá)。

TLR2主要通過在傷害感受信號通路中誘發(fā)神經(jīng)炎癥從而參與慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展。與正常小鼠相比，外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺過敏以及伴隨的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和脊髓炎癥基因的表達(dá)，在TLR2基因缺陷小鼠中被抑制[23]。外周神經(jīng)損傷后，在受損部位或DRGs出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤，且TLR2的表達(dá)上調(diào)，可能參與外周神經(jīng)炎癥反應(yīng)，例如TLR2介導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1，也稱為CCL2）表達(dá)的上調(diào)[24]。在臨床研究中，與無痛病人相比，患有慢性疼痛的病人分離的外周血單核細(xì)胞對TLR2、TLR4和TLR7激動劑的反應(yīng)有所增強(qiáng)[25]。近來，蛋白聚糖(aggrecan)的32個氨基酸殘基的片段能直接激活背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元產(chǎn)生MCP-1，參與骨性關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)病過程[26]。這個結(jié)果提示，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上表達(dá)的TLR2也參與外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥過程（見圖2）。

圖1 哺乳動物免疫細(xì)胞中經(jīng)典的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖

2.TLR3和疼痛

TLR3識別雙鏈RNA并通過TRIF途徑啟動信號，導(dǎo)致通過IRF3釋放I型干擾素和通過NF-κB釋放炎性細(xì)胞因子。關(guān)于TLR3與疼痛機(jī)制的研究相對較少。有研究表明，脊髓中TLR3的表達(dá)隨著神經(jīng)損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化或施加TLR3激動劑而表達(dá)升高[27]。通過鞘內(nèi)注射反義寡核苷酸選擇性敲低TLR3表達(dá)，能夠減輕慢性胰腺炎后的機(jī)械性異常性疼痛[28]。TLR3基因缺陷小鼠也顯示神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的異常性疼痛的緩解。然而，由TLR3所識別的內(nèi)源性DAMPs，目前仍不清楚。

3.TLR4與疼痛

越來越多的證據(jù)表明，TLR4可能是促進(jìn)與慢性疼痛發(fā)病機(jī)制相關(guān)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體之一[29]。先前發(fā)現(xiàn)，TLR4廣泛表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和外周初級感覺神經(jīng)元上。就神經(jīng)元表達(dá)的TLR4而言，其主要在DRG和TG中的初級感覺神經(jīng)元表達(dá)，可參與初級感覺神經(jīng)元的激活或敏化，并直接促成疼痛信號傳導(dǎo)的發(fā)生。TLR4在辣椒素敏感的小直徑神經(jīng)元上表達(dá)，與瞬時受體電位香草酸1 (TRPV1)和ATP門控嘌呤能受體P2X3共表達(dá)[30]。TLR4激動劑脂多糖(LPS)能夠增強(qiáng)TRPV1+的感覺神經(jīng)元的放電頻率[30]，因此通過TLR4依賴性機(jī)制直接影響初級感覺神經(jīng)元的超興奮性。有實驗表明，初級感覺神經(jīng)元的TRPA1也可能是LPS作用的另一個分子靶點[31]。由DRG的初級感覺神經(jīng)元表達(dá)的神經(jīng)元TLR4也通過使表達(dá)TRPV1的神經(jīng)元敏感增強(qiáng)而參與紫杉醇誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病變及疼痛（見圖2）[32]。

免疫細(xì)胞中TLR4的激活可以導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，間接增強(qiáng)初級感覺神經(jīng)元的興奮性[29]。外周神經(jīng)損傷或炎性后，脊髓中的TLR4的表達(dá)增加[33]。鞘內(nèi)注射幾種結(jié)構(gòu)不同的TLR4拮抗劑LPS-RS（來自Rhodobacter sphaeroides的LPS）、(+)- 納洛酮和(+)-納曲酮（它們不結(jié)合于阿片受體），能夠抑制神經(jīng)損傷引起的機(jī)械疼痛超敏反應(yīng)[21]。鞘內(nèi)注射針對TLR4的siRNA或反義寡核苷酸以敲低TLR4的表達(dá)，可以減弱由外周神經(jīng)損傷、骨癌和脊髓損傷誘導(dǎo)的痛覺超敏反應(yīng)[21]。有趣的是，鞘內(nèi)注射TLR4激動劑LPS在雄性小鼠中產(chǎn)生疼痛，而不是雌性小鼠中，表明TLR4參與神經(jīng)性疼痛存在性別差異[34]。TLR4基因缺陷小鼠表現(xiàn)出由外周神經(jīng)損傷、關(guān)節(jié)炎或自身免疫性神經(jīng)病引起的痛覺超敏反應(yīng)的顯著降低[29]。有證據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)表達(dá)TLR4有助于嗎啡誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥進(jìn)而參與嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)生[35]。嗎啡與MD-2的疏水核心結(jié)合（類似于LPS的脂質(zhì)A的部分）并誘導(dǎo)TLR4寡聚化，導(dǎo)致NFκB介導(dǎo)的促炎性介質(zhì)如IL-1β、TNF和一氧化氮的釋放[36]。阿片類藥物誘導(dǎo)的痛覺過敏(OIH)意味著阿片類藥物暴露后導(dǎo)致機(jī)體對疼痛的敏感性增加。其中也涉及到小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR4及其下游信號NLRP3炎性小體的參與[37]?；熕幬镎T導(dǎo)的外周神經(jīng)病變(CIPN)及疼痛是與化療藥物（如紫杉醇）的細(xì)胞毒性作用相關(guān)的嚴(yán)重不良后果，其特征是神經(jīng)性疼痛可在化療藥物停止治療后持續(xù)很長時間。研究表明，紫杉醇與MD2結(jié)合并誘導(dǎo)TLR4寡聚化，導(dǎo)致促炎反應(yīng)[32]。因此，盡管需要更好地了解哪些條件對藥理學(xué)靶向TLR4的反應(yīng)最佳，但是TLR4受體拮抗劑可能有益于多種慢性疼痛疾病，包括神經(jīng)性疼痛、炎性疼痛、OIH和CIPN。

圖2 哺乳動物神經(jīng)元中非經(jīng)典的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖

TLR4識別的內(nèi)源性DAMPs可能是TLR4介導(dǎo)的疼痛的罪魁禍?zhǔn)?，盡管尚不清楚哪個DAMPs在此過程中是必需的。涉及哪些DAMPs可能取決于組織器官的不同。TLR4識別的幾種可能的內(nèi)源性DAMPs包括HSP60、HSP90、分泌到細(xì)胞外的HMGB1、生腱蛋白-C（屬于細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白）和半乳糖凝集素-3等[29]。有趣的是，最近的報道表明腸道微生物群也可能是TLRs配體的體內(nèi)重要來源。早期研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏腸道微生物群的無菌小鼠中，由炎性疼痛引起的機(jī)械疼痛超敏反應(yīng)減少[38]。最近，在清除腸道微生物群后，化療藥物奧沙利鉑誘導(dǎo)的機(jī)械痛覺過敏顯著性降低，并且這些作用依賴于循環(huán)造血細(xì)胞上表達(dá)的TLR4[39]。近來發(fā)現(xiàn)，腦中內(nèi)皮細(xì)胞上的TLR4識別腸道中革蘭氏陰性細(xì)菌的LPS并導(dǎo)致腦海綿狀血管畸形，而這種TLR4介導(dǎo)的病理可通過干預(yù)腸道微生物組來預(yù)防[40]。因此，推測靶向干預(yù)腸道微生物群，也能調(diào)節(jié)TLR信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

4.TLR5與疼痛

細(xì)胞膜TLR5識別細(xì)菌的鞭毛蛋白(flagellin)，它是革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的結(jié)構(gòu)蛋白。如圖1所示，TLR5的二聚化導(dǎo)致轉(zhuǎn)接分子MyD88依賴性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。近來研究發(fā)現(xiàn)，TLR5在初級感覺神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。原位雜交和免疫組織化學(xué)分析顯示，TLR5主要表達(dá)在小鼠DRGs的中大型有髓鞘Aβ纖維上，它支配后爪無毛的皮膚并延伸到脊髓背角的深層[41]。TLR5也表達(dá)在人的DRG神經(jīng)元中。L5脊神經(jīng)結(jié)扎導(dǎo)致的機(jī)械痛敏在TLR5基因敲除小鼠中有所減弱。鞭毛蛋白激活神經(jīng)元TLR5后，QX-314（一種膜不可滲透的利多卡因的衍生物）通過未知的一種通道進(jìn)入神經(jīng)元，導(dǎo)致鈉電流的阻斷，這主要發(fā)生在小鼠DRG的大直徑Aβ纖維神經(jīng)元中。鞭毛蛋白和QX-314的共同施加能夠抑制化療、神經(jīng)損傷和糖尿病神經(jīng)病變后的機(jī)械痛覺過敏。結(jié)果表明，TLR5介導(dǎo)的Aβ纖維沉默有望治療神經(jīng)性疼痛。近來的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可能作為TLR5的內(nèi)源性配體候選者[42]。HMGB1在體外引發(fā)TLR5介導(dǎo)的MyD88信號級聯(lián)，包括NFκB依賴性炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，例如TNF、IL-8和iNOS[42]。將鞭毛蛋白或HMGB1直接注射到大鼠的后爪中產(chǎn)生急性疼痛，其可被TLR5拮抗劑所抑制。因此，結(jié)果表明TLR5對細(xì)胞外內(nèi)源性的HMGB1的識別，可能誘發(fā)痛覺過敏[42]。最近，過表達(dá)miR-150可以抑制TLR5介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，包括大鼠周圍神經(jīng)損傷后的COX-2、白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α的表達(dá)，從而大大減輕了神經(jīng)性疼痛[43]?？傊?，TLR5介導(dǎo)的神經(jīng)免疫信號通過產(chǎn)生促炎介質(zhì)而導(dǎo)致慢性疼痛。另一方面，初級感覺神經(jīng)元中的神經(jīng)元TLR5的激活也可能參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

5.TLR7和疼痛

表達(dá)在內(nèi)體上的TLRs通過感知核酸而促進(jìn)先天免疫應(yīng)答。這些內(nèi)體中存在的TLRs被認(rèn)為不同程度的表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和初級感覺神經(jīng)元上。研究表明，培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元上表達(dá)TLR3、TLR7和TLR9，給予它們的特異性激動劑可增加TRPV1表達(dá)以及DRG感覺神經(jīng)元的活性，并且能增加前列腺素E2的釋放[44]。提示內(nèi)體TLRs在DRG的初級感覺神經(jīng)元中功能性表達(dá)。

TLR7識別單鏈RNA并啟動MyD88依賴性途徑，以釋放NF-κB介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子或IRF7介導(dǎo)的I型IFN的轉(zhuǎn)錄（見圖1）。盡管在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中有低水平TLR7的表達(dá)，但是TLR7在DRG初級感覺神經(jīng)元，特別是表達(dá)TRPV1的神經(jīng)元上有表達(dá)[45]。最近的研究結(jié)果揭示了細(xì)胞外miRNA通過TLR7-TRPA1快速激發(fā)傷害感受神經(jīng)元的新穎作用[46]。值得注意的是，miRNA let-7b與TLR7結(jié)合并激活TRPA誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元中快速內(nèi)向電流和動作電位。這些電生理效應(yīng)需要Let-7b的GUUGUGU基序[46]。足底內(nèi)注射let-7b引起快速自發(fā)性疼痛，這些反應(yīng)依賴于TLR7和TRPA1的表達(dá)[46]。因此，細(xì)胞外miRNAs可能作為內(nèi)源性DAMPs，通過激活TLR7和TRPA1從而引發(fā)疼痛。

6.TLR8和疼痛

最近的研究發(fā)現(xiàn)，DRG上初級感覺神經(jīng)元中的TLR8及其內(nèi)源性配體miR-21共同導(dǎo)致小鼠的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[47]。TLR8主要在中小型IB4+非肽能神經(jīng)元中表達(dá)，并且在小鼠神經(jīng)病理性疼痛的維持期間，TLR8陽性神經(jīng)元的百分比有所增加。在Tlr8-/-小鼠中，神經(jīng)損傷引起的機(jī)械痛敏和脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)或紫杉醇(PTX)誘導(dǎo)的熱痛敏顯著降低。在Tlr8-/-小鼠中，SNL后脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少與神經(jīng)病理性疼痛行為的減少相一致。有趣的是，TLR8激動劑(VTX-2337)未激活DRG中的NF-κB。在鞘內(nèi)注射VTX-2337后，p-ERK表達(dá)顯著增加，而不是p38和JNK。在野生型(WT)和MyD88-/-小鼠中鞘內(nèi)注射TLR8激動劑劑量依賴性地誘導(dǎo)機(jī)械痛敏，表明TLR8激動劑誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏和ERK活化并不依賴于MyD88。

TLR8可識別單鏈RNA (ssRNA)和microRNA，并導(dǎo)致免疫細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Zhang等發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達(dá)在神經(jīng)病理性疼痛的條件下顯著增加[47]。鞘內(nèi)注射miR-21 可降低WT小鼠（而不是Tlr8-/-小鼠）的縮足閾值以及p-ERK 表達(dá)的增加，誘導(dǎo)DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2和CXCL1的表達(dá)增加。miR-21顯著增加WT小鼠的DRG神經(jīng)元中的動作電位的發(fā)放，但不增加Tlr8-/-小鼠的動作電位的發(fā)放。因此，miR-21在DRG中調(diào)節(jié)疼痛、激活ERK、產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性的作用需要TLR8的介導(dǎo)（見圖2）。

7.TLR9和疼痛

TLR9定位于內(nèi)體中被DNA與未甲基化的CpG二核苷酸激活，并啟動MyD88依賴性信號傳導(dǎo)以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和激活I(lǐng)RF7以產(chǎn)生IFNs。通過全身應(yīng)用CpG ODN 2088阻斷TLR9信號傳導(dǎo)減少炎癥信號傳導(dǎo)并改善腫瘤誘導(dǎo)的熱痛敏[44]和脊髓損傷誘導(dǎo)的熱痛敏反應(yīng)[48]。并且，TLR9拮抗劑或TLR9基因缺陷小鼠中，紫杉醇誘發(fā)的機(jī)械痛敏減弱[49]。紫杉醇導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤到背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，并且這種浸潤不受TLR9基因缺陷的影響。紫杉醇處理巨噬細(xì)胞和DRG組織使TNF和CXCL1的表達(dá)上調(diào)。足底內(nèi)注射紫杉醇激活的巨噬細(xì)胞引起機(jī)械痛敏。有趣的是，TLR9突變或用TLR9抑制劑僅在雄性動物中發(fā)揮作用。最終，TLR9的拮抗劑減少了雌性裸鼠（具有T細(xì)胞和B細(xì)胞缺陷的表型）中紫杉醇誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏。總之，小鼠巨噬細(xì)胞中TLR9信號傳導(dǎo)在化療藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛的發(fā)病中，具有明顯的性別差異[49]。但是，在慢性疼痛下，哪種內(nèi)源性配體激活TLR9途徑參與疼痛，仍不清楚。

8.Toll樣受體的輔助蛋白和疼痛

新的證據(jù)表明，TLR的輔助蛋白和轉(zhuǎn)接分子也參與慢性疼痛的發(fā)病過程。輔助蛋白CD14顯著增強(qiáng)TLR4對LPS的識別，并促進(jìn)TLR2-TLR6異二聚體的免疫應(yīng)答。與野生型小鼠相比，CD14基因缺陷小鼠的神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏和熱痛敏的反應(yīng)顯著降低。在CD14基因缺陷小鼠中，在中樞施用TLR4激動劑纖連蛋白、CNS創(chuàng)傷和缺血性中風(fēng)后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活和單核細(xì)胞的募集有所減弱[21]。因此，CD14介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可能參與TLRs對DAMP的識別以及組織損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

轉(zhuǎn)接分子MyD88是幾乎所有TLR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)所必需的（除TLR3外），也參與慢性疼痛的發(fā)病機(jī)制。外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)傷害性途徑中的MyD88表達(dá)，包括DRG和脊髓中磷酸化的NFκB，磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和IL-1水平升高[50]。鞘內(nèi)注射MyD88同源二聚化抑制肽能夠減弱機(jī)械痛敏和熱痛敏。盡管在表達(dá)Nav1.8的初級感覺神經(jīng)元中條件性敲除Myd88的小鼠中，基礎(chǔ)痛閾和急性炎性疼痛未受影響，但在這些小鼠的慢性神經(jīng)病和炎性疼痛顯著減弱[50]。

雖然其他TLRs在慢性疼痛中的作用仍然未知，但我們推測，在多種病理條件下，不同的TLR的激活可能導(dǎo)致不同的持續(xù)性疼痛狀態(tài)?？傊?，越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元和非神經(jīng)細(xì)胞中的TLRs及其相關(guān)的信號網(wǎng)絡(luò)參與慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展。靶向TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能成為緩解慢性疼痛的新策略。

五、Toll樣受體和癢覺

新的研究表明，TLRs對于瘙癢的發(fā)生發(fā)展也是至關(guān)重要的。TLRs激活產(chǎn)生疼痛或瘙癢，可能取決于入侵的外源性PAMPs和內(nèi)源性DAMPs的性質(zhì)。

1.TLR3和癢覺

研究發(fā)現(xiàn)，TLR3可能是介導(dǎo)小鼠慢性瘙癢的突觸傳遞和中樞敏化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[51]。TLR3表達(dá)在TRPV1+以及GRP+的DRG的小直徑初級感覺神經(jīng)元中，而且還被轉(zhuǎn)運至投射到脊髓背角的中樞軸突末端。TLR3激動劑可以誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)向電流和動作電位。TLR3激動劑在WT小鼠中引發(fā)抓撓，但不引起TLR3基因敲除小鼠的抓撓行為。此外，脊髓背角II層神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞和脊髓的長時程增強(qiáng)(LTP)現(xiàn)象在TLR3基因敲除小鼠中受損[51]。此外，在TLR3基因敲除小鼠中，組胺依賴性和非依賴性急性瘙癢和皮膚干燥誘發(fā)的慢性瘙癢顯著降低。因此，TLR3可通過增加外周初級感覺神經(jīng)元的興奮性和增強(qiáng)脊髓中的脊髓突觸傳遞來調(diào)節(jié)瘙癢的中樞敏化過程。但參與瘙癢的TLR3的內(nèi)源性配體尚不清楚。

2.TLR4和癢覺

越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元和非神經(jīng)元中TLR4對急性和慢性瘙癢也有重要作用。盡管TLR4表達(dá)在TRPV1+的DRG感覺神經(jīng)元上，但DRG神經(jīng)元中LPS對TLR4的激活不會引發(fā)內(nèi)向電流和動作電位[52]。皮內(nèi)注射TLR4激動劑LPS也不能誘導(dǎo)小鼠的急性瘙癢。在TLR4基因敲除小鼠中，組胺誘導(dǎo)的急性瘙癢減少，并且組胺誘導(dǎo)的感覺神經(jīng)元中的細(xì)胞內(nèi)鈣信號和內(nèi)向電流在TLR4基因缺陷的小鼠也顯著減少[53]。在TLR4基因缺陷的DRG神經(jīng)元中，組胺的敏感性降低可能是由于TRPV1活性降低所致[53]。因此，初級感覺神經(jīng)元表達(dá)的TLR4通過增強(qiáng)TRPV1活性可增強(qiáng)組胺誘導(dǎo)的瘙癢信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但它不足以誘導(dǎo)急性瘙癢。

近來的研究發(fā)現(xiàn)，由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的TLR4被認(rèn)為在慢性瘙癢中起關(guān)鍵作用，但不參與急性瘙癢[52]。干皮病、接觸性皮炎和過敏性接觸性皮炎相關(guān)的慢性瘙癢，在TLR4基因敲除小鼠顯著減少[52]。鞘內(nèi)注射TLR4拮抗劑LPS-RS不影響急性瘙癢，但抑制干皮病誘導(dǎo)的慢性瘙癢。干皮病能使TLR4的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，并且能誘導(dǎo)脊髓背角中表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4的表達(dá)增加。有趣的是，慢性瘙癢引起的抓撓在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞增生中起著重要作用[52]。另一項研究表明，由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)信號傳導(dǎo)可以介導(dǎo)慢性瘙癢誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖[54,55]。Lipocalin-2 (LCN2)同時被鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞STAT3依賴性的免疫因子，對慢性瘙癢的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[55]。這些發(fā)現(xiàn)表明，由TLR4和STAT3信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，對于慢性瘙癢的發(fā)展起關(guān)鍵作用。

最近的研究表明，抗菌肽人源β-防御素2 (hBD2)在銀屑病病人中的表達(dá)大幅增加[56]。在小鼠中，hBD2誘導(dǎo)了瘙癢反應(yīng)，并且與野生型小鼠相比，hBD2在TLR4敲除小鼠中誘導(dǎo)的瘙癢顯著減少[56]。此外，皮膚的免疫細(xì)胞（而非DRG神經(jīng)元表達(dá)的）TLR4介導(dǎo)小鼠中hBD2誘導(dǎo)的瘙癢[56]。因此，該結(jié)果表明，皮膚細(xì)胞表達(dá)的TLR4（可能是巨噬細(xì)胞），可能在慢性瘙癢中起關(guān)鍵作用。

3.TLR7和癢覺

TLR7被證明由DRG初級感覺神經(jīng)元表達(dá)，其與TRPV1、胃泌素釋放肽(gastrin releasing peptide, GRP)、TRPA1和 MrgprA3共表達(dá)[45]。皮內(nèi)注射TLR7的配體咪喹莫特或洛索立賓，劑量依賴性誘導(dǎo)小鼠抓撓行為。在急性分離的小鼠DRG神經(jīng)元中，TLR7配體咪喹莫特和洛索立賓引發(fā)快速內(nèi)向電流和動作電位，表明TLR7配體可直接激活DRG神經(jīng)元。與野生型小鼠相比，TLR7基因敲除小鼠表現(xiàn)出正常的熱和機(jī)械疼痛，并且炎癥和神經(jīng)性疼痛的行為也未改變[45]。值得注意的是，TLR7基因敲除小鼠顯示出對組胺非依賴性瘙癢的顯著減少，包括氯喹、內(nèi)皮素-1和SLIGRL-NH2等。因此，TLR7對于組胺依賴性瘙癢是必需的，但對于急性疼痛的發(fā)生可能并不必要。

值得注意的是，動物行為、膜片鉗記錄和鈣成像的研究揭示了令人驚訝的結(jié)果，咪喹莫特誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元的活化與TLR7無關(guān)[57]。最近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特是一種直接的但較弱的TRPA1激動劑，可激活一部分表達(dá)TRPA1的神經(jīng)元，TRPA1是咪喹莫特誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元激活所必需的，也是咪喹莫特誘導(dǎo)瘙癢行為的原因[58]，這些數(shù)據(jù)表明，初級感覺神經(jīng)元表達(dá)的TLR7可能并不是咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠瘙癢所必需的。最近發(fā)現(xiàn)，分泌的細(xì)胞外miRNA (let-7b)作為一種新的疼痛介質(zhì)，可通過激活傷害感受神經(jīng)元中的TLR7和TRPA1起作用[46]。鑒于疼痛刺激可以在慢性瘙癢條件下轉(zhuǎn)變?yōu)轲W，miRNA let-7b也可能作為TLR7的新型內(nèi)源性配體參與慢性瘙癢?？傊?，病理條件下釋放的內(nèi)源性配體可能通過激活神經(jīng)元或非神經(jīng)元TLR7受體，進(jìn)而參與瘙癢信號的產(chǎn)生。

六、結(jié)論及臨床意義

盡管大量的結(jié)果表明，神經(jīng)元和非神經(jīng)元中TLRs介導(dǎo)疼痛和瘙癢信號的產(chǎn)生，提示TLRs可能代表一種緩解慢性疼痛和慢性瘙癢的新型治療靶點。但是，我們?nèi)孕枰紤]以下幾個關(guān)鍵問題。首先，大多數(shù)研究使用的是全身性TLRs基因敲除的動物，導(dǎo)致TLRs在所有細(xì)胞類型中缺乏，因此很難將行為學(xué)表型歸因于特定細(xì)胞類型，例如免疫細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)或神經(jīng)元。不同類型的細(xì)胞中TLRs在疼痛和瘙癢中的確切作用，需要應(yīng)用條件性TLR基因敲除動物。其次，相同的TLR在不同類型的細(xì)胞上具有不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。例如，神經(jīng)元TLRs的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與非神經(jīng)元TLR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就明顯不同。再次，鑒于TLRs廣泛表達(dá)并且具有正常生理功能，包括啟動先天免疫應(yīng)答發(fā)應(yīng)，故TLRs拮抗劑可能會產(chǎn)生不良反應(yīng)。選擇性靶向TLRs可能比廣泛抑制更具有優(yōu)勢，以避免一些潛在的不良反應(yīng)。最后，在組織或神經(jīng)損傷或皮膚損傷后釋放的TLRs的內(nèi)源性配體是什么？這些內(nèi)源性TLR配體在不同的病理性疼痛和瘙癢癥狀下，作用于神經(jīng)元或非神經(jīng)元細(xì)胞的具體機(jī)制是什么？TLRs識別內(nèi)源性配體的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的闡明，最終可通過改進(jìn)的藥物設(shè)計產(chǎn)生更好的藥物治療效果。

包括炎性疼痛和神經(jīng)性疼痛在內(nèi)的各種慢性疼痛，影響全世界大約15億人。慢性瘙癢也是與皮膚病、全身性疾病和代謝紊亂相關(guān)的常見臨床問題。慢性疼痛和瘙癢大大降低了人們的生活質(zhì)量，而臨床的治療效果不盡如人意。本文中綜述了Toll樣受體介導(dǎo)疼痛和瘙癢信號的分子機(jī)制。闡明TLRs介導(dǎo)疼痛和瘙癢信號的分子機(jī)制，將為治療疼痛和瘙癢提供潛在的治療新靶點。