4種食品中5-羥甲基糠醛在模擬胃腸消化過程中的變化

曾睿，鄒悅瑜，王歌，歐仕益

(暨南大學，食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)是食品中的一種內(nèi)源污染物，低濃度的HMF具有抗氧化、抗心肌缺血的作用[1]；但高濃度的HMF具有細胞毒性[2]、遺傳毒性[3]和致癌性[4]，對眼睛、黏膜和皮膚都有刺激作用[5]。除此之外，HMF容易氧化形成致癌物羥甲基糠酰磺酸鹽(5-sulfoxymethyfurfural，SMF)[6]，HOIE課題組[7]證明了，HMF通過轉(zhuǎn)變?yōu)镾MF對人體產(chǎn)生危害，DE LA CUEVA[8]等證明了HMF能夠在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化成SMF，后者與DNA形成加合物，具有致癌活性。

HMF的形成與碳水化合物含量豐富食品的熱加工過程密切相關(guān)[9]，其主要產(chǎn)生途徑有以下2種：一是果糖或葡萄糖在高溫條件下，烯醇化、脫水、環(huán)化生成HMF[10]，其中3-脫氧奧蘇糖和不飽和奧蘇糖是2種重要的前體物質(zhì)[11-12]；二是蔗糖或果糖裂解成果糖呋喃陽離子，它是HMF的直接前體物質(zhì)[13]，能夠在高溫干燥的條件下快速轉(zhuǎn)化為HMF[14]，是比3-脫氧奧蘇糖更高效的形成途徑[15]。HMF在食品熱加工中還受到pH[16]、水分活度、糖的種類[17]和二價陽離子[18]的影響。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，食品中形成的HMF可與氨基酸結(jié)合形成氨基酸-HMF加合物[19]，從而降低食品中HMF含量。食物在胃腸道消化過程中，蛋白質(zhì)會水解成氨基酸，pH也發(fā)生變化。但對HMF含量高的食物在消化過程中HMF的變化規(guī)律缺少研究。本研究選用4種市面上常見的熱加工食品作研究對象(咖啡、餅干、薯片、方便面)，探討4種食品經(jīng)過模擬胃腸道消化前后的HMF變化規(guī)律，以期為HMF的風險評估提供依據(jù)。

1 實驗材料與設備

1.1 材料與試劑

康師傅油炸方便面(香菇燉雞)，康師傅控股有限公司；樂事薯片(原味)，樂事薯片公司；太平梳打餅干(奶鹽味)，億滋食品有限公司；雀巢咖啡(原味)，雀巢中國有限公司。

胃蛋白酶(豬源，15 000 u/g)、唾液淀粉酶(1 500 u/g)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰酶(4 000 u/g)，合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀(配備SPD-M20A光電二極管陣列檢測器)，日本島津公司；Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，安捷倫儀器有限公司；紫外分光光度計UV-900，北京瑞利分析儀器公司。

2 實驗方法

2.1 系列模擬消化液配備

按MINEKUS[20]等的方法配制模擬唾液(simulated salivary fluid，SSF)并進行模擬消化試驗，模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid，SIF)，具體配方見表1。

表1 不同模擬消化液儲備液的配制

2.2 體外模擬消化過程

(1)模擬口腔消化

取5 g供試食品研磨成粉末放入錐形瓶中，加入3.5 mL的模擬唾液、25 μL的CaCl2儲備液、975 μL水和0.5 mL 1 500 U唾液淀粉酶液，混合均勻后于37 ℃恒溫振蕩器上消化水解2 min，以模擬口腔咀嚼消化過程。

(2)模擬胃部消化

將模擬口腔消化產(chǎn)物中加入7.5 mL的模擬胃液、5 μL的CaCl2儲備液、695 μL的水和1.6 mL 25 000 U的胃蛋白酶液，用0.2 mL的1 mol/L HCl調(diào)節(jié)消化體系的pH值至3，混合均勻后于37 ℃恒溫振蕩器上消化2 h，模擬胃部消化過程。

(3)模擬腸道消化

于模擬胃部消化產(chǎn)物中加入16 mL的模擬腸液、40 μL的CaCl2儲備液、860 μL的水、2.5 mL膽鹽和1 g胰酶，用0.6 mL的1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)消化體系的pH值至7，混合均勻后于37 ℃恒溫振蕩器上消化2 h，模擬腸部消化過程。

每個食品重復3次。每段模擬消化后取樣，采用HPLC法測定HMF含量。色譜分析條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長284 nm，流動相為去離子水，柱溫40 ℃，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL。

2.3 4種食品消化后的氨基酸分析

氨基酸總量采用茚三酮顯色法進行測定，游離氨基酸采用氨基酸自動分析儀進行測定。

2.3.1 食品模擬消化物中氨基酸總量測定

分別取餅干、咖啡、方便面、薯片胃消化產(chǎn)物和腸消化產(chǎn)物2 mL于離心管中，加入等體積水稀釋，然后加入4 mL石油醚混合搖勻，靜置沉降15 min后以3 000 r/min離心15 min，去除有機層(脫脂)，測定水相中氨基酸含量。

取上述處理后樣品液0.5 mL于比色管中加水定容至5 mL，從中取出0.5 mL液體與0.5 mL檸檬酸-磷酸緩沖液和1 mL茚三酮溶液均勻混合，置于沸水浴15 min后取出，冷卻至室溫后于分光光度計測定吸光值(波長570 nm)。以亮氨酸作為標準氨基酸，繪制標準曲線，計算樣品中氨基酸總量。

2.3.2 食品消化物中游離氨基酸含量的測定

在國標GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定方法》[21]基礎上調(diào)整方法測定餅干、咖啡、方便面和薯片胃腸道消化產(chǎn)物中游離氨基酸含量。主要分為以下4個步驟：定容→脫脂→沉淀蛋白質(zhì)→衍生→上機檢測。

取4種食品的模擬胃腸消化產(chǎn)物2 mL，加入等體積水，旋渦混合。加入等體積石油醚旋渦萃取，靜置30 min后離心(4 000 r/min，15 min)除去脂肪。取水相2 mL于試管中，加入2 mL三氯乙酸，靜置1 h后離心(4 000 r/min，15 min)，除去蛋白質(zhì)。取上清液，過0.45 μm濾膜。

準確吸取0.200 ml混合氨基酸標準液，用pH 2.2的緩沖液稀釋至5 mL，此標準稀釋液濃度為5.00 nmol/50 μL，作為上機測定用的氨基酸標準，采用氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量。其檢測條件為：進樣量20 μL；離子交換柱磺酸型陽離子樹脂(4.6 mm ×60 mm, 3 μm)；柱溫57 ℃；分離緩沖液流速0.4 mL/min；反應溫度135 ℃；茚三酮反應液流速0.35 mL/min；檢測波長440 nm和570 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 4種食品在模擬消化條件下HMF的變化

4種食品經(jīng)過體外模擬消化后的HMF含量見表2。

表2 餅干、咖啡、薯片、方便面胃腸道消化產(chǎn)物HMF含量變化

注：*和**表示與未消化食品相比，HMF含量分別在5%和1%水平上存在差異。

由表2可知，方便面、餅干和薯片中HMF含量相近而咖啡中含量很高。經(jīng)過模擬胃消化后，方便面、薯片及餅干中的HMF含量均升高，分別增加15.5%，44.9%和135%，但咖啡消化后HMF卻下降。

模擬腸消化后，4種食品的HMF含量均大幅下降，方便面和咖啡的HMF殘留量分別下降78.4%和74.1%，餅干和薯片中HMF的殘留量低于檢測限。由此可見，在胃消化過程中被釋放的HMF于腸消化環(huán)境中被大量消除，消除機理可能是食品中的蛋白質(zhì)酶解出大量的游離氨基酸，氨基酸與食品里面的5-HMF反應重新形成加合物[19]。

3.2 4種食品消化產(chǎn)物中HMF的可能消減機理

HAMZALIOGLU和GOKMEN[22]認為，食品高溫加工過程中產(chǎn)生的HMF前體物質(zhì)3-脫氧奧蘇糖(3-DG)和不飽和奧蘇糖(3,4-DG)累積在食品當中，在胃環(huán)境下3-DG和3,4-DG能夠轉(zhuǎn)化為HMF，從而使HMF含量增加。但這很難解釋咖啡中出現(xiàn)的相反現(xiàn)象。我們推測速溶咖啡中半胱氨酸含量較高，HMF在酸性條件下會形成加合物[23]，從而降低HMF含量。

為了驗證上述推測，我們測定了模擬胃腸消化后游離氨基酸含量(表3)。結(jié)果表明，被試食品的氨基酸總量均有大幅度增長，由多及少順序依次為咖啡>薯片>方便面>餅干。半胱氨酸對HMF的消除能力最強[19]，表3結(jié)果表明，釋放的半胱氨酸含量順序依次為咖啡>方便面>薯片>餅干，而表2中HMF增加量順序依次為餅干>薯片>方便面，咖啡中的HMF含量下降，說明蛋白質(zhì)中釋放的半胱氨酸在HMF的消減中起重要作用。

基于我們的近期研究[23]，加合物的形成會降低HMF對細胞的毒性。因此，在攝食HMF含量高的食品的同時，適量攝入蛋白質(zhì)可消除HMF的危害。

表3 餅干、咖啡、薯片、方便面模擬胃腸消化產(chǎn)物氨基酸含量 單位：μg/mL

4 結(jié)論

除咖啡外，相比食品原樣，方便面、薯片和餅干經(jīng)模擬胃消化后HMF的含量均增加，推測食品中HMF加合物在胃的低pH環(huán)境下被釋放HMF。經(jīng)過模擬腸消化后，所有食品中HMF的含量大幅降低，主要是因為HMF與食品蛋白質(zhì)水解后的游離氨基酸結(jié)合形成氨基酸-HMF加合物，其中半胱氨酸可能起重要作用。加合物的細胞毒性大大低于HMF，因此攝入足夠量的蛋白質(zhì)可緩解HMF的危害。