雞細(xì)小病毒與H9 亞型禽流感病毒三重PCR 檢測方法的建立*

李丹， 謝芝勛，李孟，謝麗基，羅思思，張艷芳，張民秀，黃嬌玲，范晴，王盛，謝志勤，鄧顯文，曾婷婷

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001）

雞細(xì)小病毒（chincken parvovirus，ChPV）為一種無囊膜單鏈DNA 病毒，由三個（NS、NP 和VP）開放閱讀框組成。ChPV 是一種能引發(fā)雞群發(fā)生腸道疾病的重要病毒之一， 在臨床上主要引起雞精神抑郁、腹瀉、生長遲緩和料肉比增加等[1]。 1983年， 細(xì)小病毒首次在發(fā)生腸炎的發(fā)育不良的火雞中發(fā)現(xiàn)[2]。 1984 年，匈牙利科學(xué)家Kisary 等人用電鏡在雞的糞便樣品中觀察到細(xì)小病毒顆粒， 隨后這些發(fā)現(xiàn)被基因組序列測定進(jìn)行確定[3-4]。 關(guān)于ChPV 的流行病學(xué)調(diào)查顯示其在商品肉雞的感染率較高，蛋雞或種雞次之[5]。 該病毒普遍地存在于某些雞群中，主要以雛雞為侵害對象，會造成患病雞的腹瀉及發(fā)育不良， 有研究表明在發(fā)育障礙與矮小綜合征雞群的血清中檢測到了ChPV DNA[6]。近年來該病毒相繼在北美、 東歐及亞洲的多個國家地區(qū)[7-9]有發(fā)現(xiàn)報道，證明ChPV 在全球多個國家的雞群中普遍存在。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于甲型流感病毒， 由于其最易發(fā)生變異以及近年來禽流感病毒的跨種傳播而受到人們的關(guān)注[10]。 依據(jù)不同AIV 毒株對雞致病性的強(qiáng)弱， 可以將AIV分為高致病性AI（HPAIV）、低致病性AIV（LPAIV）和非致病性AI（NPAIV)。H9亞型AIV 屬于LPAIV，家禽感染發(fā)病后臨床癥狀多表現(xiàn)為輕微的呼吸道癥狀，同時還會造成蛋雞的產(chǎn)蛋率下降、肉雞的生長發(fā)育遲緩等；野禽、水禽和家禽攜帶該病毒時大部分不表現(xiàn)出任何明顯的臨床癥狀， 但會對機(jī)體造成一定的損傷， 是目前影響我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要禽類病毒病之一[11]。 H9N2亞型AIV 最早于1966 年在美國威斯康辛州的火雞中被分離到[12]。我國廣東地區(qū)于1994 年首次在AIV 引起發(fā)病的雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIV[13]。 研究表明H9亞型AIV 容易與其他病原（病毒和細(xì)菌等）混合感染加重疾病造成的損失； 其還可以與其它不同亞型的AIV 混合感染，并在宿主體內(nèi)發(fā)生基因片段重組，產(chǎn)生一些不可預(yù)知的新型流感病毒， 進(jìn)而可能引起大流行。 H9亞型AIV 可以跨種屬屏障感染人類，上世紀(jì)90 年代末以來多次發(fā)生H9N2亞型AIV感染人的事件，特別是對2013 年以來引起人感染的H5N6、H7N9和H10N8亞型AIV 的基因來源分析中發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部基因均來自H9N2亞型AIV[14-16]。 由上述報道可見，H9N2亞型AIV 與ChPV 都對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。

由于ChPV 很難在正常雞胚和細(xì)胞中增殖培養(yǎng)，目前僅依靠PCR 技術(shù)直接檢測腸道內(nèi)容物或泄殖腔棉拭子樣品中是否存在目標(biāo)病原的核酸，進(jìn)而判斷樣品有無該病原體的感染。目前，禽流感病毒的診斷方法較多， 其中最常用的是分子生物學(xué)方法，特別是PCR 檢測方法，其具有簡便、敏感性高及特異性好的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。近年來，由于多重PCR 診斷技術(shù)隨著科技的發(fā)展而不斷完善，同時只有對多種病原體混合感染的優(yōu)點(diǎn)，而且可以大大縮短對混合樣品進(jìn)行逐項檢測的時間， 已經(jīng)被成熟應(yīng)用于多種動物病原混合感染的診斷。 為此，本研究根據(jù)H9亞型AIV HA 基因、所有AIV 的M 基及ChPV 的NS 基因的保守序列，設(shè)計3 對針對兩種病毒的特異性引物，建立了ChPV與H9亞型AIV 三重PCR 檢測方法， 不僅可以快速準(zhǔn)確地鑒別上述兩種不同病原的混合感染，而且為ChPV 與H9亞型AIV 的有效防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 試劑包括： 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司的試劑有2×PCR Super Mix，DNA/RNA 共提試劑盒、 小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、PCR 產(chǎn)物快速連接載體和DNA Marker；購自寶生物（北京）有限公司的試劑有M-MLV、 隨機(jī)引物、dNTP 及RNA抑制劑；其它試劑均購自商業(yè)公司。 儀器包括：購自美國Bio-Rad Laboratories 公司的PCR 儀，購自美國Thermo 公司的超微量分光光度計。

1.1.2 毒株 毒株（H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV 和MDV） 均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；H7N2亞型AIV 的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈；H5N1亞型AIV 的cDNA 模板由美國康涅狄格州立大學(xué)惠贈； 其它AIV（H2N3、H8N4、H10N3和H11N3）毒株或cDNA 模板均由香港大學(xué)惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計和合成 運(yùn)用DNAStar 軟件將GenBank 中 下 載 的ChPV NS 基 因、AIV M 基 因 和H9亞型AIV HA 基因的核苷酸序列進(jìn)行比對，分別對三種目的基因進(jìn)行特異性保守區(qū)域的篩選，采用Primer6.0 和Oligo6.0 軟件設(shè)計特異性引物，并通過NCBI BLAST 在線驗(yàn)證其特異性， 篩選出分別針對三種目的基因的3 對特異性引物。 設(shè)計出的引物序列見表1。 上述引物均由賽默飛廣州分公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 病毒RNA/DNA 的提取與RNA 的反轉(zhuǎn)錄 參照試劑盒使用說明書， 運(yùn)用 DNA/RNA 抽提試劑盒對試驗(yàn)中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV 的DNA/RNA 進(jìn)行抽提，并用33μL DEPC水溶解抽提后的DNA/RNA。 參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書對RNA 病毒的抽提產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有產(chǎn)物置-30℃保存。

1.2.3 三重RT-PCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 該方 法 的PCR 反 應(yīng) 體 系 為25μL：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5μL， 作 為 模 板ChPV DNA 和H9亞型AIV cDNA 各加入1μL，再分10 個梯度各加入0.1～1.0μL 對引物ChPV-F 、ChPV-R、H9-F、H9-R、M-F 和M-R (25pmol/μL)進(jìn)行濃度的優(yōu)化，最后用超純水將反應(yīng)總體積補(bǔ)足至25μL。 為最終確定最佳的反應(yīng)體系及條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)效果對退火溫度及時間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 為驗(yàn)證所建立的三重RTPCR 檢測方法的特異性， 運(yùn)用該法將H1N2、H2N3、H3N2、H5N1、H6N2、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV 和MDV 的RNA/DNA 按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測。 對擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行純化回收， 連接到載體pMD18-T 上并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）中進(jìn)行克隆，挑選陽性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 分別以ChPV DNA 與H9N2亞型AIV cDNA 為模板， 用特定的引物對ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9N2亞型AIV HA基因的全長片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到其ChPV NS基因、M 基因和HA 基因的全長目的片段，再分別將這三個基因片段連接到pMD18-T 的載體中并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）中進(jìn)行克隆，挑選陽性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。 將含有ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV的HA 基因片段的3 種重組質(zhì)粒分別命名為NST、M-T 和H9-T。 用質(zhì)粒抽提試劑盒提取NS-T、M-T 和H9-T 的質(zhì)粒，并用微量核酸檢測儀對其進(jìn)行核酸濃度的測定， 根據(jù)分子質(zhì)量和核酸濃度計算對應(yīng)的拷貝數(shù)， 將NS-T、M-T 和H9-T 等拷貝數(shù)混合，并進(jìn)行10 倍倍比稀釋，以得到NS-T、MT 和H9-T 質(zhì)粒DNA 濃度均 為5×109～5×101拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 為檢測該方法的敏感性，運(yùn)用所建立的ChPV、AIV M 基因和H9亞型禽流感病毒三重RT-PCR 的檢測方法對NS-T、M-T 和H9-T 質(zhì)粒濃度為5×107～5×102拷貝/μL 的樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

1.2.7 臨床樣品檢測 對活禽市場采集的130 份雞咽喉及泄殖腔拭子運(yùn)用建立的三重PCR 檢測方法進(jìn)行檢測鑒定， 同時將病料處理后接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離鑒定， 并進(jìn)行HA 基因全長擴(kuò)增。 同時經(jīng)ChPV NS 基因陽性PCR 產(chǎn)物和HA 基因全長克隆送測序公司進(jìn)行測序， 然后將上述結(jié)果進(jìn)行比較，驗(yàn)證三重RT-PCR 的檢測結(jié)果。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 三重RT-PCR 條件的優(yōu)化 通過對ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因3 種引物濃度的測定及擴(kuò)增溫度時間等的優(yōu)化，最終確定三重PCR 最佳反應(yīng)體系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5μL，ChPV DNA 和H9亞型AIV cDNA 各1μL 作 為 模 板， 引 物H9-F 和H9-R(25pmol/μL)各加入0.5μL，引物ChPV-F 和ChPVR(25pmol/μL)則分別加入0.8μL，引物M-F 和M-R(25pmol/μL)則分別加入0.8μL，最后用超純水補(bǔ)足至25μL。 最終優(yōu)化的反應(yīng)條件為：95℃5min；進(jìn)入95℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 45s，共35 個循環(huán)；然后再72℃延伸10min，最后4℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2.2 特異性試驗(yàn) 該法對ChPV 及H9亞型AIV混合感染樣品能檢測出3 條特異性的條帶， 分別為551bp （ChPV）、249bp （AIV M 基 因 通 用）及378bp（H9亞型）；對ChPV 檢測結(jié)果僅出現(xiàn)1 條特異性條帶， 片段大小為551bp； 對H9N2與H9N6亞型AIV 進(jìn)行擴(kuò)增檢測出2 條特異性條帶， 片段大小分別為378bp 和249bp；對其他亞型AIV 出現(xiàn)1條特異性249bp 條帶， 其它常見的禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶， 結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。 特異性結(jié)果見圖1。

2.2.3 敏感性試驗(yàn) 運(yùn)用該方法針對5×107～5×102拷 貝/μL 的ChPV NS、AIV M 基 因 和H9亞 型AIV HA 基因的質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，對濃度為5×107～5×104拷貝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因質(zhì)粒均可擴(kuò)增出3 條明顯的特異性條帶，片段大小分別為551bp、249bp 和378bp； 對濃度等于或小于5×103拷貝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因質(zhì)粒均無擴(kuò)增條帶。 由此可見，該法最低能檢測到5×104拷貝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亞型AIV HA 基因質(zhì)粒。 敏感性結(jié)果見圖2。

2.2.4 臨床樣品檢測 運(yùn)用該方法對廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從南寧活禽市場采集的130 份雞口腔及泄殖腔的棉拭子樣品進(jìn)行了檢測， 檢測結(jié)果顯示：有2 份樣品能同時擴(kuò)增出551bp、249bp和378bp 的目的條帶， 為ChPV 和H9亞 型AIV 混合感染陽性； 有6 份樣品能同時擴(kuò)增出378bp 和249bp 的目的條帶，為H9亞型AIV 單一感染陽性；13 份樣品僅能擴(kuò)增出551bp 的目的條帶，為ChPV單一感染陽性；3 份樣品僅能擴(kuò)增出249bp 的目的條帶， 為除H9亞型外的H3和H6亞型AIV 感染。同時對上述樣品進(jìn)行病毒分離鑒定和HA 基因測序，其結(jié)果與三重PCR 檢測結(jié)果100%相符，說明該方法具有一定的實(shí)用性。 部分臨床樣品檢測結(jié)果見圖3。

3 討論

研究表明， 雞的腸道性疾病例如病毒性腹瀉給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失， 其中引起雞腸炎及腹瀉等癥狀ChPV 在臨床上也經(jīng)常檢出[17]。另外， 在出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和活動障礙的肉雞群中也檢測到ChPV 感染，臨床還存在ChPV 隱性感染或者與其它病毒及細(xì)菌混合感染的情況， 進(jìn)而引起生長發(fā)育受阻，出現(xiàn)“僵雞”及飼料料肉比下降等[18]。另外由于ChPV 引起的臨床癥狀與其它病毒較相似，且在臨床上極易呈現(xiàn)出混合感染的病例，給臨床上鑒別診斷帶來困難。 研究還發(fā)現(xiàn)ChPV 具有垂直傳播的潛在可能， 可能造成種蛋的孵化率下降及雞胚發(fā)育吸收不良的情況增加。ChPV 疫苗研發(fā)的最大障礙是其在細(xì)胞和雞胚上不能大量增殖， 現(xiàn)在還沒有有效的商品化疫苗防治ChPV 感染。 目前，國內(nèi)雖然沒有關(guān)于ChPV 暴發(fā)和流行的相關(guān)報道， 但是本實(shí)驗(yàn)室在對廣西地區(qū)不同品種和日齡雞群監(jiān)測的結(jié)果表明ChPV 在某些品種和日齡雞群的感染率依然很高。 因此，對于ChPV 的監(jiān)測及防控也是十分迫切和必要的， 建立一種快速的鑒別診斷方法可以為該病的監(jiān)測及防控提供有力的技術(shù)支撐。

H9亞型禽流感是目前對家禽養(yǎng)殖業(yè)危害最為嚴(yán)重的疾病之一，其在全球各個地方均有發(fā)生，而H9N2亞型AIV 在我國雞群中流行最為廣泛。 H9N2亞型AIV 可以跨越種屬屏障直接感染人類， 嚴(yán)重威脅人類公共健康的安全。 AIV 基因組由8 個獨(dú)立節(jié)段組成，分別為HA、NA、M、PB1、PB2、PA、NP和NS[19]。 由于AIV 抗原在自然條件容易發(fā)生變異，臨床上易導(dǎo)致新的AIV 亞型出現(xiàn)，而且會發(fā)生多種亞型AIV 的混合感染， 其引起的癥狀又極其相似，給精確鑒別診斷造成了巨大的困惑。 在AIV的所有基因片段中，HA 基因的變異最頻繁， 同時也是變異最大的， 因此HA 基因的分型鑒定引物根據(jù)其變異而不斷的進(jìn)行更新。 M 基因因其保守性更強(qiáng)，經(jīng)常被用來設(shè)計AIV 通用引物。

由于經(jīng)典的病毒分離鑒定方法存在檢測鑒定禽流感病毒的周期較長， 而常用的血清學(xué)方法則需要較多不同亞性標(biāo)準(zhǔn)陽性血清且不同亞型血清之間的抗原存在不同程度的血清學(xué)交叉反應(yīng)，因此這些傳統(tǒng)檢測方法均存在不同程度的局限性。分子生物學(xué)特別是PCR 檢測方法對AIV 進(jìn)行鑒定與分型目前最常用的檢測方法， 也是WHO 與OIE 推薦的方法之一[20]。 該方法快速準(zhǔn)確、操作簡便、平均樣品檢測成本相對較低，得到了廣泛的認(rèn)可與應(yīng)用推廣。 近年來，國內(nèi)外已有檢測ChPV 和AIV 的PCR 診斷技術(shù)和方法的研究， 而且多重PCR 技術(shù)在不同禽病混合感染診斷中的應(yīng)用越來越多[21-24]。 本研究建立H9亞型AIV 與ChPV 三重PCR 檢測方法可以快速診斷和鑒別H9亞型AIV或者ChPV 單獨(dú)和混合感染。 我們建立方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示， 多種亞型AIV 和ChPV 混合感染時依然能特異擴(kuò)增出目的基因的條帶； 敏感性試驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)兩種病毒混合感染時，該方法依然能夠清晰擴(kuò)增出兩種病毒的目的基因片段； 臨床試驗(yàn)結(jié)果說明建立的H9亞型AIV 和ChPV 三重PCR 檢測方法能夠直接進(jìn)行臨床樣品的檢測， 為臨床上兩種不同疾病的快速鑒別和診斷提供了良好的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化三重PCR 反應(yīng)條件， 成功建立雞細(xì)小病毒、禽流感病毒M 基因和H9亞型禽流感病毒三重PCR 檢測方法，該方法能夠快速準(zhǔn)確的鑒別ChPV、AIV 與H9亞型AIV， 為多種疾病的

有效防控提供技術(shù)支撐。