外源脯氨酸對Cd脅迫下107楊光合與葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2020-02-07 11:57:42趙串串侯文濤溫懷峰汲紹文余登舉
環(huán)境科學(xué)研究 2020年1期
趙串串, 侯文濤, 溫懷峰, 汲紹文, 王 雪, 余登舉
陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021
近年來，植物修復(fù)技術(shù)為解決土壤Cd污染提供了一條全新治理途徑而備受人們關(guān)注[1]. 研究發(fā)現(xiàn)，木本植物中速生的楊柳科具有生物量大、根系發(fā)達(dá)、對Cd耐性好、經(jīng)濟(jì)可行、抑制Cd污染向食物鏈中轉(zhuǎn)移等優(yōu)勢，故將其應(yīng)用于Cd污染土壤的修復(fù)具有良好的前景[2-3]. 當(dāng)前，利用楊樹修復(fù)Cd污染的研究主要集中于低濃度Cd脅迫對楊樹光合作用[4]及葉綠素?zé)晒鈪?shù)[5]、葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[6]、干物質(zhì)分配的影響[7]，而關(guān)于外源添加物下楊樹對高濃度Cd脅迫的光合生理響應(yīng)研究較少[8].
脯氨酸是植物體內(nèi)水溶性最大的氨基酸，也是干旱、高溫、高鹽、冰凍、紫外光照射和重金屬等逆境脅迫下植物體內(nèi)積累的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[9-10]，外源脯氨酸可以提高逆境脅迫下植物的抗氧化能力，促進(jìn)植物生長，從而提高植物耐受能力[11-12]. 目前，關(guān)于外源脯氨酸緩解Cd對植物的脅迫研究主要集中在較低濃度Cd對小麥[13]、白菜[14]和稻谷[15]等農(nóng)作物生理影響的研究，而高濃度Cd脅迫下外源脯氨酸對楊樹光合生理指標(biāo)的影響還有待進(jìn)一步揭示，因此該文以107楊苗木為試驗(yàn)材料，基于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，探討高濃度Cd脅迫下外源脯氨酸對107楊葉片光合氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，以期從光合生理角度闡明外源脯氨酸對107楊抗Cd脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)一步提高107楊的耐Cd能力，將其應(yīng)用于礦區(qū)高濃度Cd污染土壤修復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.
1 材料與方法
1.1 供試材料
試驗(yàn)材料107楊(Populus×euramericanacv. ‘7476’)采自陜西省楊凌示范區(qū)，2018年3月上旬將地徑約1 cm的一年生107楊苗木截成長20 cm的枝條，在自然光放置于Hoagland營養(yǎng)液[16]中水培，每2 d換一次營養(yǎng)液，15 d后選擇長勢一致的苗木移栽到內(nèi)徑30 cm、深40 cm的塑料盆中，1株盆，生長基質(zhì)采用田園土(每盆6 kg). 苗木移栽后，每天對所有供試植株統(tǒng)一澆蒸餾水，消除水分脅迫的影響，每周添加100～200 mL Hoagland營養(yǎng)液保證養(yǎng)分供給，1個(gè)月后選擇生長勢均勻的107楊實(shí)生苗進(jìn)行外源脯氨酸處理和Cd脅迫處理.
1.2 試驗(yàn)處理
根據(jù)前期試驗(yàn)研究和相關(guān)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，土壤中w(Cd)為100 mgkg左右時(shí)會對107楊光合作用產(chǎn)生明顯脅迫. 為此該試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)試驗(yàn)因素，即外源脯氨酸處理和Cd脅迫處理，其中，外源脯氨酸處理設(shè)3個(gè)水平——0、10和20 mmolL，Cd脅迫處理設(shè)4個(gè)水平——0、100、200和300 mgkg. 試驗(yàn)共設(shè)12個(gè)處理，分別記為0Cd+0Pro(對照)、0Cd+10Pro、0Cd+20Pro、100Cd+0Pro、100Cd+10Pro、100Cd+20Pro、200Cd+0Pro、200Cd+10Pro、200Cd+20Pro、300Cd+0Pro、300Cd+10Pro和300Cd+20Pro，每個(gè)處理均設(shè)5次重復(fù)，共計(jì)60盆. Cd脅迫處理是以分析純CdCl2·2.5H2O 配置成相應(yīng)濃度的Cd溶液施入盆栽土壤中，外源脯氨酸處理是以每天傍晚在107楊苗木葉面噴施等量的去離子水或不同濃度的脯氨酸進(jìn)行，處理期間每隔1 d更換處理液，以葉面剛好完全打濕為標(biāo)準(zhǔn)，每天對所有供試植株進(jìn)行統(tǒng)一管理，采用質(zhì)量差減法使各處理保持相同的土壤含水量. 2018年6月中旬測定苗木葉片光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù).
1.3 測定指標(biāo)和方法
1.3.1氣體交換參數(shù)的測定
2018年6月中旬選擇晴朗的天氣，于09:00—11:00進(jìn)行光合參數(shù)測定. 使用LI-6400便攜式光合儀(LI-Cor Inc.，USA)測定107楊葉片在光強(qiáng)1 200 μmol(m2·s)下的葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等參數(shù). 107楊苗葉片木水分利用效率(WUE)的計(jì)算公式為WUE=PnTr[18]. 測定過程中的環(huán)境狀況：氣溫為(22.45±2.31)℃，相對濕度為57.13%±2.45%，空氣中CO2濃度為(379.51±13.25)μmolmol. 各處理均測定5次，結(jié)果取其平均值.
1.3.2光合光響應(yīng)曲線的測定
2018年6月中旬選擇晴朗的天氣，于09:30—11:00選取107楊苗木中長勢一致的成熟葉片作為測定對象，采用Li-6400便攜式光合測定儀配置紅藍(lán)光源(LI-Cor Inc.，USA)測定葉片光合作用對光合有效輻射(PAR)的響應(yīng)曲線，測定過程中，氣體流速控制為500 μmol(m2·s)，使用CO2鋼瓶控制葉室CO2濃度為380 μmolmol，由溫度控制器控制葉室溫度為25 ℃，6400-02B LED紅藍(lán)光源提供不同PAR，PAR梯度設(shè)定為 2 000、1 800、1 500、1 200、900、700、500、300、200、100、75、50、25和0 μmol(m2·s). 在測定前，葉片先用 1 200 μmol(m2·s)的光強(qiáng)適應(yīng)30 min，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后進(jìn)入自動測量程序，測定結(jié)束后繪制凈光合速率的光響應(yīng)曲線(Pn-PAR)，并依據(jù)直角雙曲線修正模型[19]，計(jì)算方法如式(1)所示. 通過SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對107楊光響應(yīng)曲線測量值進(jìn)行非線性回歸擬合，得到暗呼吸速率〔Rd，μmol(m2·s)〕、光補(bǔ)償點(diǎn)〔LCP，μmol(m2·s)〕、最大凈光合速率〔Pnmax，μmol(m2·s)〕和光合量子效率(AQY，molmol)等光合生理參數(shù).
(1)
式中：Pn為凈光合速率，μmol(m2·s)；PAR為光合有效輻射，μmol(m2·s)；α為光響應(yīng)曲線的初始斜率；β為修正系數(shù)；γ為光飽和項(xiàng)；Rd為植物暗呼吸速率，μmol(m2·s).
1.3.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定
采用Li-6400便攜式光合測定儀配置熒光葉室6400-40于08:30—11:30對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定，選取與光合-光響應(yīng)曲線測量相同的葉片，經(jīng)過30 min暗適應(yīng)后，照射檢測光測定最小熒光(Fo)，然后施加飽和脈沖為 7 200 μmol(m2·s)的光強(qiáng)照射0.8 s，測得暗適應(yīng)下的最大熒光(Fm)，熒光參數(shù)的計(jì)算參照Rohacek[20]的方法，PSⅡ中原初反應(yīng)最大量子效率(FvFm)的計(jì)算公式為FvFm=(Fm-Fo)Fm. 用葉室內(nèi)活化光將植株充分活化1 h，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后在 1 200 μmol(m2·s) 的光強(qiáng)下測定光適應(yīng)下植株葉片的最大熒光(Fm′)、最小熒光(Fo′)和穩(wěn)態(tài)熒光(Fs). 基于以上參數(shù)計(jì)算表觀光合電子傳遞速率(ETR)、實(shí)際光化學(xué)量子效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)及非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)等熒光參數(shù).
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行多重比較(Tukey′s法，α=0.05)，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)來揭示Cd脅迫處理與外源脯氨酸處理及二者交互作用對107楊葉片光合與葉綠素?zé)晒獾戎笜?biāo)的影響；采用Origin 8.6軟件作圖.
2 結(jié)果與分析
2.1 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊氣體交換參數(shù)的影響
表1 不同Cd添加量下外源脯氨酸處理對107楊葉片光合氣體交換參數(shù)的影響
Table 1 Effect of exogenous proline on photosynthetic gas exchange parameters in leaves of P. × euramericana cv.‘7476’ under different Cd addition levels
表1 不同Cd添加量下外源脯氨酸處理對107楊葉片光合氣體交換參數(shù)的影響
項(xiàng)目w(Cd) ∕(mg∕kg)c(脯氨酸)∕(mmol∕L)Pn∕[μmol∕(m2·s)]Gs∕[mol∕(m2·s)]Tr∕[mmol∕(m2·s)]Ci∕(μmol∕mol)WUE∕(μmol∕mmol)試驗(yàn)處理顯著性分析021.42±1.15a0.37±0.02a5.35±0.36a240.87±28.04a4.00±0.28a01021.64±1.01a0.36±0.02a5.32±0.23a242.36±20.03a4.07±0.30a2021.17±0.59a0.35±0.02a5.17±0.36a250.01±26.02a4.29±0.35a014.09±0.80b0.24±0.02b3.97±0.25b308.19±27.03b3.24±0.35b1001021.43±0.70a0.34±0.02a5.42±0.26a248.34±26.04a3.95±0.36a2020.61±1.03a0.30±0.03ab5.29±0.40a253.30±26.04a3.89±0.24ab07.91±1.04c0.14±0.02c2.30±0.35c358.12±20.02c2.70±0.25c2001017.66±0.96e0.26±0.03b4.04±0.31b310.26±25.03b3.88±0.30ab2016.30±1.20be0.30±0.03ab3.97±0.32b319.30±20.03b3.28±0.32b04.56±0.99d0.10±0.01d1.56±0.30c368.10±22.01c1.80±0.21d300107.54±0.86c0.13±0.02c1.83±0.29c362.13±20.02c2.13±0.22cd208.12±0.98c0.12±0.02cd2.00±0.19c300.12±21.02b2.01±0.30dc(脯氨酸)NSNSNSNSNSw(Cd)*******c(脯氨酸)×w(Cd)*********
注： 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=15. 每列數(shù)據(jù)右側(cè)字母相同者表示差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)； 字母不同者表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)．雙因素方差分析結(jié)果： NS表示無顯著差異； *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.
2.2 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊光響應(yīng)特征參數(shù)的影響
由圖1可見，隨著光強(qiáng)的增加，不同處理?xiàng)l件下107楊葉片Pn表現(xiàn)出先逐漸上升后趨于平緩的趨勢. 在PAR<200 μmol(m2·s) 水平下，Pn隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)而迅速增加，當(dāng)PAR>800 μmol(m2·s) 時(shí)Pn逐漸達(dá)到光飽和點(diǎn). 與對照組相比，單獨(dú)外源脯氨酸處理對107楊葉片光響應(yīng)曲線幾乎沒有影響，Cd脅迫處理顯著影響107楊葉片Pn的變化，使其Pn值低于對照組；與單獨(dú)Cd脅迫處理對比，外源脯氨酸處理顯著增加了Pn值. 在w(Cd)>200 mgkg條件下，PAR>1 800 μmol(m2·s) 時(shí)，光響應(yīng)曲線下降明顯，產(chǎn)生光抑制現(xiàn)象. 107楊葉片Rd、Pnmax和AQY均隨著脅迫強(qiáng)度的增加逐漸下降，在w(Cd)<200 mgkg、單獨(dú)脯氨酸處理下，各處理組107楊葉片的光響應(yīng)參數(shù)均無顯著差異(P<0.05).
由圖2可見，與單獨(dú)Cd脅迫處理組相比，外源脯氨酸處理顯著提高了植株P(guān)nmax、Rd和AQY，降低了LCP，提高了光能利用效率. 雙因素方差分析(見表2)表明，Cd脅迫作為獨(dú)立因子顯著影響了107楊葉片的光響應(yīng)參數(shù)(P<0.05)，而外源脯氨酸作為獨(dú)立因子對光響應(yīng)參數(shù)無顯著影響，與單獨(dú)Cd脅迫處理組相比，交互處理顯著影響了植株的光響應(yīng)參數(shù)(P<0.01).
圖1 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊葉片光響應(yīng)曲線的影響Fig.1 Effect of exogenous proline on light response curves in leaves of P. × euramericana cv.‘7476’under Cd stress
2.3 不同濃度脯氨酸對Cd脅迫下107楊葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
由圖3可見，隨著w(Cd)的增加，107楊葉片的FvFm、ΦPSⅡ、qP和ETR均呈下降趨勢，且各處理之間差異顯著(P<0.05)；NPQ明顯升高，與單獨(dú)Cd脅迫處理組差異顯著(P<0.05). 雙因素方差分析(見表3)表明，Cd作為獨(dú)立因子時(shí)會顯著影響FvFm、ΦPSⅡ、qP、ETR和NPQ，外源脯氨酸作為單獨(dú)因子時(shí)對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)無顯著影響. 與單獨(dú)Cd脅迫處理相比，交互條件下外源脯氨酸處理的植株具有更高的qP、ΦPSⅡ以及更低的NPQ.
c(脯氨酸)(mmolL): 1—0； 2—10； 3—20.
圖3 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.3 Effect of exogenous proline on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’ under Cd stress
表2 脯氨酸、Cd及其交互效應(yīng)對107楊葉片光響應(yīng)參數(shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
Table 2 Statistical significance of the single and interactive of Cd, proline on light response parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’
表2 脯氨酸、Cd及其交互效應(yīng)對107楊葉片光響應(yīng)參數(shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
因子RdPnmaxLCPAQYc(脯氨酸)NSNSNSNSw(Cd)****c(脯氨酸)×w(Cd)********
注： *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.
3 討論
在逆境脅迫下，當(dāng)植物本身產(chǎn)生的脯氨酸不足以消除逆境傷害時(shí)，可以使用外源脯氨酸來緩解逆境傷害[21]，外源脯氨酸在增強(qiáng)作物對干旱、鹽、高溫和重金屬等逆境脅迫耐性方面具有重要的作用[22]. 該研究結(jié)果表明，107楊葉片的Pn、Gs隨著w(Cd)的增大而降低，同時(shí)伴隨著Ci的升高，說明Cd脅迫下107楊葉片光合作用的降低是由于非氣孔因素導(dǎo)致的. 這與馮世靜等[23]對灰楊(Populus×canescens)和青楊(Populuspseudo-simonii)在Cd脅迫條件下的響應(yīng)特征相似. Cd脅迫下，107楊葉片光合電子傳遞反應(yīng)受阻，用于碳固定Rubisco羧化酶活性受到抑制，阻礙了CO2的利用，從而造成胞間CO2積累，這與高會玲等[24]對Cd脅迫下菊芋光合作用和徐小遜等[25]對Cd脅迫下豨薟光合作影響的研究結(jié)論一致，同時(shí)Cd會引起光合作用暗反應(yīng)中ATP和NADPH利用率的下降[26]，進(jìn)而降低107楊的碳固定效率. Zouari等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中施加不同濃度Cd可不同程度地降低椰棗樹(PhoenixdactyliferaL.)的Pn、Gs、Tr、WUE，而外源添加20 mmolL的脯氨酸可明顯緩解Cd脅迫對光合作用的抑制作用，且不同處理之間的緩解程度有所不同. 該研究結(jié)果表明，Cd脅迫下，添加外源c(脯氨酸)為10和20 mmolL后，Pn、Tr和Gs與單獨(dú)Cd處理組相比均得到顯著提高、Ci均降低，這與楊曉春等[28]在Cd脅迫下外源6-BA對茄子苗木生長光合特性的研究結(jié)果一致，說明外源脯氨酸可通過緩解對107楊非氣孔的限制，從而促進(jìn)PSⅡ在Cd脅迫下對CO2的吸收和利用，增加植物光能捕獲，提高光化學(xué)效率[29]，緩解Cd對光合作用的抑制作用.
表3 Cd、脯氨酸及其交互效應(yīng)對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
Table 3 Statistical significance of the single and interactive of Cd, proline on chlorophyII fluorescence parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’
表3 Cd、脯氨酸及其交互效應(yīng)對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
因子Fv∕FmΦPSⅡqPNPQ ETRc(脯氨酸)NSNSNSNSNSw(Cd)*****c(脯氨酸)×w(Cd)*******
注： *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.
光合光響應(yīng)模型所獲得的光合生理參數(shù)是甄別植物光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)狀況、不同生境的光合能力及適應(yīng)規(guī)律的有效依據(jù)[30]. 該研究中，107楊葉片Pnmax、AQY和Rd均隨著Cd脅迫的加重而顯著降低，LCP顯著升高，表明Cd脅迫降低了107楊葉片在強(qiáng)光和弱光下的光合效率和光能利用能力，107楊通過減少呼吸作用的消耗來維持自身代謝平衡，對光強(qiáng)具有一定的適應(yīng)性，同時(shí)也可能是Cd脅迫限制了其生理活性，減少了對于能量的需求，這與鄭明瑜等[31]對Cd脅迫下煙草光合作用的研究結(jié)果一致. 在w(Cd)分別為100和200 mgkg條件下，外源添加c(脯氨酸)為10 mmolL時(shí)會使107楊葉片Pnmax分別提高46.61%和60.11%，說明外源脯氨酸處理可顯著緩解Cd脅迫對107楊葉片Pnmax的抑制作用. 此外，不同濃度Cd脅迫下，外源添加c(脯氨酸)為10 mmolL時(shí)均會不同程度地提高107楊葉片的AQY和Rd，降低LCP，說明外源脯氨酸處理可顯著提高Cd脅迫下107楊葉片光合效率和利用弱光的能力.
在活體狀態(tài)下，植物的葉綠素?zé)晒馊坑蒔SⅡ反應(yīng)中心產(chǎn)生[32]. PSⅡ原初反應(yīng)的FvFm和ΦPSⅡ是判斷植物是否受到光抑制的重要指標(biāo)，是研究植物對逆境脅迫響應(yīng)的理想?yún)?shù)[33-34]. 正常條件下，植物通常表現(xiàn)出較高的FvFm和ΦPSⅡ值，可以使植物獲得較高的光能轉(zhuǎn)化效率，從而有利于能量的同化積累[35]. 該研究中，w(Cd)為200 mgkg時(shí)，與對照組相比，107楊葉片F(xiàn)vFm和ΦPSⅡ分別下降12.41%和37.88%，說明107楊葉片的原初光化學(xué)效率和從天線色素到PSⅡ反應(yīng)中的傳能效率明顯受到Cd脅迫的影響，出現(xiàn)了光抑制現(xiàn)象. 同時(shí)，107楊葉片的qP和ETR也隨w(Cd)的升高而顯著降低，NPQ的變化規(guī)律則相反，這與甘龍等[36]對Cd脅迫下一年蓬(Erigeronannuus)葉綠素?zé)晒馓匦缘难芯拷Y(jié)果一致，說明Cd脅迫使107楊葉片的光合機(jī)構(gòu)受到一定程度的傷害，PSⅡ反應(yīng)中心氧化端電子傳遞受阻，光能轉(zhuǎn)化效率以及捕獲激發(fā)能的效率受到影響，用于熱耗散等非光化學(xué)反應(yīng)的能量增加.w(Cd)為200 mgkg時(shí)，與單獨(dú)Cd脅迫處理組相比，外源添加c(脯氨酸)為10和20 mmolL下107楊ETR顯著提高了63.26%和50.92%，并以c(脯氨酸)為10 mmolL處理時(shí)的效果更佳，表明外源脯氨酸處理緩解了Cd對反應(yīng)中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到一定程度的恢復(fù)，從而使植物能夠維持正常的暗反應(yīng)等基本生理功能.
4 結(jié)論
a) Cd脅迫對107楊光合相關(guān)生理過程的影響較為復(fù)雜. 在w(Cd)低于200 mgkg時(shí)，添加外源脯氨酸可有效促進(jìn)107楊的光合作用和提高水分利用效率，從而降低高濃度Cd脅迫對107楊光合作用的抑制，且以c(脯氨酸)為10 mmolL的效果較好；在w(Cd)為300 mgkg時(shí)，107楊的生長明顯受到抑制，外源脯氨酸處理雖能夠起到一定緩解作用，但作用較小.
b)w(Cd)低于200 mgkg時(shí)，添加外源脯氨酸能夠通過非氣孔限制來提高107楊葉片ΦPSⅡ、qP和ETR，緩解Cd對反應(yīng)中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到一定程度的恢復(fù)，進(jìn)而緩解Cd脅迫對107楊的傷害，在礦區(qū)高濃度Cd污染地區(qū)的生態(tài)恢復(fù)中具有一定的應(yīng)用潛力.
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趙串串, 侯文濤, 溫懷峰, 汲紹文, 王 雪, 余登舉
陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021
近年來，植物修復(fù)技術(shù)為解決土壤Cd污染提供了一條全新治理途徑而備受人們關(guān)注[1]. 研究發(fā)現(xiàn)，木本植物中速生的楊柳科具有生物量大、根系發(fā)達(dá)、對Cd耐性好、經(jīng)濟(jì)可行、抑制Cd污染向食物鏈中轉(zhuǎn)移等優(yōu)勢，故將其應(yīng)用于Cd污染土壤的修復(fù)具有良好的前景[2-3]. 當(dāng)前，利用楊樹修復(fù)Cd污染的研究主要集中于低濃度Cd脅迫對楊樹光合作用[4]及葉綠素?zé)晒鈪?shù)[5]、葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[6]、干物質(zhì)分配的影響[7]，而關(guān)于外源添加物下楊樹對高濃度Cd脅迫的光合生理響應(yīng)研究較少[8].
脯氨酸是植物體內(nèi)水溶性最大的氨基酸，也是干旱、高溫、高鹽、冰凍、紫外光照射和重金屬等逆境脅迫下植物體內(nèi)積累的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[9-10]，外源脯氨酸可以提高逆境脅迫下植物的抗氧化能力，促進(jìn)植物生長，從而提高植物耐受能力[11-12]. 目前，關(guān)于外源脯氨酸緩解Cd對植物的脅迫研究主要集中在較低濃度Cd對小麥[13]、白菜[14]和稻谷[15]等農(nóng)作物生理影響的研究，而高濃度Cd脅迫下外源脯氨酸對楊樹光合生理指標(biāo)的影響還有待進(jìn)一步揭示，因此該文以107楊苗木為試驗(yàn)材料，基于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，探討高濃度Cd脅迫下外源脯氨酸對107楊葉片光合氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，以期從光合生理角度闡明外源脯氨酸對107楊抗Cd脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)一步提高107楊的耐Cd能力，將其應(yīng)用于礦區(qū)高濃度Cd污染土壤修復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.
1 材料與方法
1.1 供試材料
試驗(yàn)材料107楊(Populus×euramericanacv. ‘7476’)采自陜西省楊凌示范區(qū)，2018年3月上旬將地徑約1 cm的一年生107楊苗木截成長20 cm的枝條，在自然光放置于Hoagland營養(yǎng)液[16]中水培，每2 d換一次營養(yǎng)液，15 d后選擇長勢一致的苗木移栽到內(nèi)徑30 cm、深40 cm的塑料盆中，1株盆，生長基質(zhì)采用田園土(每盆6 kg). 苗木移栽后，每天對所有供試植株統(tǒng)一澆蒸餾水，消除水分脅迫的影響，每周添加100～200 mL Hoagland營養(yǎng)液保證養(yǎng)分供給，1個(gè)月后選擇生長勢均勻的107楊實(shí)生苗進(jìn)行外源脯氨酸處理和Cd脅迫處理.
1.2 試驗(yàn)處理
根據(jù)前期試驗(yàn)研究和相關(guān)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，土壤中w(Cd)為100 mgkg左右時(shí)會對107楊光合作用產(chǎn)生明顯脅迫. 為此該試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)試驗(yàn)因素，即外源脯氨酸處理和Cd脅迫處理，其中，外源脯氨酸處理設(shè)3個(gè)水平——0、10和20 mmolL，Cd脅迫處理設(shè)4個(gè)水平——0、100、200和300 mgkg. 試驗(yàn)共設(shè)12個(gè)處理，分別記為0Cd+0Pro(對照)、0Cd+10Pro、0Cd+20Pro、100Cd+0Pro、100Cd+10Pro、100Cd+20Pro、200Cd+0Pro、200Cd+10Pro、200Cd+20Pro、300Cd+0Pro、300Cd+10Pro和300Cd+20Pro，每個(gè)處理均設(shè)5次重復(fù)，共計(jì)60盆. Cd脅迫處理是以分析純CdCl2·2.5H2O 配置成相應(yīng)濃度的Cd溶液施入盆栽土壤中，外源脯氨酸處理是以每天傍晚在107楊苗木葉面噴施等量的去離子水或不同濃度的脯氨酸進(jìn)行，處理期間每隔1 d更換處理液，以葉面剛好完全打濕為標(biāo)準(zhǔn)，每天對所有供試植株進(jìn)行統(tǒng)一管理，采用質(zhì)量差減法使各處理保持相同的土壤含水量. 2018年6月中旬測定苗木葉片光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù).
1.3 測定指標(biāo)和方法
1.3.1氣體交換參數(shù)的測定
2018年6月中旬選擇晴朗的天氣，于09:00—11:00進(jìn)行光合參數(shù)測定. 使用LI-6400便攜式光合儀(LI-Cor Inc.，USA)測定107楊葉片在光強(qiáng)1 200 μmol(m2·s)下的葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等參數(shù). 107楊苗葉片木水分利用效率(WUE)的計(jì)算公式為WUE=PnTr[18]. 測定過程中的環(huán)境狀況：氣溫為(22.45±2.31)℃，相對濕度為57.13%±2.45%，空氣中CO2濃度為(379.51±13.25)μmolmol. 各處理均測定5次，結(jié)果取其平均值.
1.3.2光合光響應(yīng)曲線的測定
2018年6月中旬選擇晴朗的天氣，于09:30—11:00選取107楊苗木中長勢一致的成熟葉片作為測定對象，采用Li-6400便攜式光合測定儀配置紅藍(lán)光源(LI-Cor Inc.，USA)測定葉片光合作用對光合有效輻射(PAR)的響應(yīng)曲線，測定過程中，氣體流速控制為500 μmol(m2·s)，使用CO2鋼瓶控制葉室CO2濃度為380 μmolmol，由溫度控制器控制葉室溫度為25 ℃，6400-02B LED紅藍(lán)光源提供不同PAR，PAR梯度設(shè)定為 2 000、1 800、1 500、1 200、900、700、500、300、200、100、75、50、25和0 μmol(m2·s). 在測定前，葉片先用 1 200 μmol(m2·s)的光強(qiáng)適應(yīng)30 min，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后進(jìn)入自動測量程序，測定結(jié)束后繪制凈光合速率的光響應(yīng)曲線(Pn-PAR)，并依據(jù)直角雙曲線修正模型[19]，計(jì)算方法如式(1)所示. 通過SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對107楊光響應(yīng)曲線測量值進(jìn)行非線性回歸擬合，得到暗呼吸速率〔Rd，μmol(m2·s)〕、光補(bǔ)償點(diǎn)〔LCP，μmol(m2·s)〕、最大凈光合速率〔Pnmax，μmol(m2·s)〕和光合量子效率(AQY，molmol)等光合生理參數(shù).
(1)
式中：Pn為凈光合速率，μmol(m2·s)；PAR為光合有效輻射，μmol(m2·s)；α為光響應(yīng)曲線的初始斜率；β為修正系數(shù)；γ為光飽和項(xiàng)；Rd為植物暗呼吸速率，μmol(m2·s).
1.3.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定
采用Li-6400便攜式光合測定儀配置熒光葉室6400-40于08:30—11:30對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定，選取與光合-光響應(yīng)曲線測量相同的葉片，經(jīng)過30 min暗適應(yīng)后，照射檢測光測定最小熒光(Fo)，然后施加飽和脈沖為 7 200 μmol(m2·s)的光強(qiáng)照射0.8 s，測得暗適應(yīng)下的最大熒光(Fm)，熒光參數(shù)的計(jì)算參照Rohacek[20]的方法，PSⅡ中原初反應(yīng)最大量子效率(FvFm)的計(jì)算公式為FvFm=(Fm-Fo)Fm. 用葉室內(nèi)活化光將植株充分活化1 h，待儀器讀數(shù)穩(wěn)定后在 1 200 μmol(m2·s) 的光強(qiáng)下測定光適應(yīng)下植株葉片的最大熒光(Fm′)、最小熒光(Fo′)和穩(wěn)態(tài)熒光(Fs). 基于以上參數(shù)計(jì)算表觀光合電子傳遞速率(ETR)、實(shí)際光化學(xué)量子效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)及非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)等熒光參數(shù).
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行多重比較(Tukey′s法，α=0.05)，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)來揭示Cd脅迫處理與外源脯氨酸處理及二者交互作用對107楊葉片光合與葉綠素?zé)晒獾戎笜?biāo)的影響；采用Origin 8.6軟件作圖.
2 結(jié)果與分析
2.1 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊氣體交換參數(shù)的影響
表1 不同Cd添加量下外源脯氨酸處理對107楊葉片光合氣體交換參數(shù)的影響
Table 1 Effect of exogenous proline on photosynthetic gas exchange parameters in leaves of P. × euramericana cv.‘7476’ under different Cd addition levels
表1 不同Cd添加量下外源脯氨酸處理對107楊葉片光合氣體交換參數(shù)的影響
項(xiàng)目w(Cd) ∕(mg∕kg)c(脯氨酸)∕(mmol∕L)Pn∕[μmol∕(m2·s)]Gs∕[mol∕(m2·s)]Tr∕[mmol∕(m2·s)]Ci∕(μmol∕mol)WUE∕(μmol∕mmol)試驗(yàn)處理顯著性分析021.42±1.15a0.37±0.02a5.35±0.36a240.87±28.04a4.00±0.28a01021.64±1.01a0.36±0.02a5.32±0.23a242.36±20.03a4.07±0.30a2021.17±0.59a0.35±0.02a5.17±0.36a250.01±26.02a4.29±0.35a014.09±0.80b0.24±0.02b3.97±0.25b308.19±27.03b3.24±0.35b1001021.43±0.70a0.34±0.02a5.42±0.26a248.34±26.04a3.95±0.36a2020.61±1.03a0.30±0.03ab5.29±0.40a253.30±26.04a3.89±0.24ab07.91±1.04c0.14±0.02c2.30±0.35c358.12±20.02c2.70±0.25c2001017.66±0.96e0.26±0.03b4.04±0.31b310.26±25.03b3.88±0.30ab2016.30±1.20be0.30±0.03ab3.97±0.32b319.30±20.03b3.28±0.32b04.56±0.99d0.10±0.01d1.56±0.30c368.10±22.01c1.80±0.21d300107.54±0.86c0.13±0.02c1.83±0.29c362.13±20.02c2.13±0.22cd208.12±0.98c0.12±0.02cd2.00±0.19c300.12±21.02b2.01±0.30dc(脯氨酸)NSNSNSNSNSw(Cd)*******c(脯氨酸)×w(Cd)*********
注： 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=15. 每列數(shù)據(jù)右側(cè)字母相同者表示差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)； 字母不同者表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)．雙因素方差分析結(jié)果： NS表示無顯著差異； *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.
2.2 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊光響應(yīng)特征參數(shù)的影響
由圖1可見，隨著光強(qiáng)的增加，不同處理?xiàng)l件下107楊葉片Pn表現(xiàn)出先逐漸上升后趨于平緩的趨勢. 在PAR<200 μmol(m2·s) 水平下，Pn隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)而迅速增加，當(dāng)PAR>800 μmol(m2·s) 時(shí)Pn逐漸達(dá)到光飽和點(diǎn). 與對照組相比，單獨(dú)外源脯氨酸處理對107楊葉片光響應(yīng)曲線幾乎沒有影響，Cd脅迫處理顯著影響107楊葉片Pn的變化，使其Pn值低于對照組；與單獨(dú)Cd脅迫處理對比，外源脯氨酸處理顯著增加了Pn值. 在w(Cd)>200 mgkg條件下，PAR>1 800 μmol(m2·s) 時(shí)，光響應(yīng)曲線下降明顯，產(chǎn)生光抑制現(xiàn)象. 107楊葉片Rd、Pnmax和AQY均隨著脅迫強(qiáng)度的增加逐漸下降，在w(Cd)<200 mgkg、單獨(dú)脯氨酸處理下，各處理組107楊葉片的光響應(yīng)參數(shù)均無顯著差異(P<0.05).
由圖2可見，與單獨(dú)Cd脅迫處理組相比，外源脯氨酸處理顯著提高了植株P(guān)nmax、Rd和AQY，降低了LCP，提高了光能利用效率. 雙因素方差分析(見表2)表明，Cd脅迫作為獨(dú)立因子顯著影響了107楊葉片的光響應(yīng)參數(shù)(P<0.05)，而外源脯氨酸作為獨(dú)立因子對光響應(yīng)參數(shù)無顯著影響，與單獨(dú)Cd脅迫處理組相比，交互處理顯著影響了植株的光響應(yīng)參數(shù)(P<0.01).
圖1 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊葉片光響應(yīng)曲線的影響Fig.1 Effect of exogenous proline on light response curves in leaves of P. × euramericana cv.‘7476’under Cd stress
2.3 不同濃度脯氨酸對Cd脅迫下107楊葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
由圖3可見，隨著w(Cd)的增加，107楊葉片的FvFm、ΦPSⅡ、qP和ETR均呈下降趨勢，且各處理之間差異顯著(P<0.05)；NPQ明顯升高，與單獨(dú)Cd脅迫處理組差異顯著(P<0.05). 雙因素方差分析(見表3)表明，Cd作為獨(dú)立因子時(shí)會顯著影響FvFm、ΦPSⅡ、qP、ETR和NPQ，外源脯氨酸作為單獨(dú)因子時(shí)對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)無顯著影響. 與單獨(dú)Cd脅迫處理相比，交互條件下外源脯氨酸處理的植株具有更高的qP、ΦPSⅡ以及更低的NPQ.
c(脯氨酸)(mmolL): 1—0； 2—10； 3—20.
圖3 外源脯氨酸處理對Cd脅迫下107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.3 Effect of exogenous proline on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’ under Cd stress
表2 脯氨酸、Cd及其交互效應(yīng)對107楊葉片光響應(yīng)參數(shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
Table 2 Statistical significance of the single and interactive of Cd, proline on light response parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’
表2 脯氨酸、Cd及其交互效應(yīng)對107楊葉片光響應(yīng)參數(shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
因子RdPnmaxLCPAQYc(脯氨酸)NSNSNSNSw(Cd)****c(脯氨酸)×w(Cd)********
注： *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.
3 討論
在逆境脅迫下，當(dāng)植物本身產(chǎn)生的脯氨酸不足以消除逆境傷害時(shí)，可以使用外源脯氨酸來緩解逆境傷害[21]，外源脯氨酸在增強(qiáng)作物對干旱、鹽、高溫和重金屬等逆境脅迫耐性方面具有重要的作用[22]. 該研究結(jié)果表明，107楊葉片的Pn、Gs隨著w(Cd)的增大而降低，同時(shí)伴隨著Ci的升高，說明Cd脅迫下107楊葉片光合作用的降低是由于非氣孔因素導(dǎo)致的. 這與馮世靜等[23]對灰楊(Populus×canescens)和青楊(Populuspseudo-simonii)在Cd脅迫條件下的響應(yīng)特征相似. Cd脅迫下，107楊葉片光合電子傳遞反應(yīng)受阻，用于碳固定Rubisco羧化酶活性受到抑制，阻礙了CO2的利用，從而造成胞間CO2積累，這與高會玲等[24]對Cd脅迫下菊芋光合作用和徐小遜等[25]對Cd脅迫下豨薟光合作影響的研究結(jié)論一致，同時(shí)Cd會引起光合作用暗反應(yīng)中ATP和NADPH利用率的下降[26]，進(jìn)而降低107楊的碳固定效率. Zouari等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中施加不同濃度Cd可不同程度地降低椰棗樹(PhoenixdactyliferaL.)的Pn、Gs、Tr、WUE，而外源添加20 mmolL的脯氨酸可明顯緩解Cd脅迫對光合作用的抑制作用，且不同處理之間的緩解程度有所不同. 該研究結(jié)果表明，Cd脅迫下，添加外源c(脯氨酸)為10和20 mmolL后，Pn、Tr和Gs與單獨(dú)Cd處理組相比均得到顯著提高、Ci均降低，這與楊曉春等[28]在Cd脅迫下外源6-BA對茄子苗木生長光合特性的研究結(jié)果一致，說明外源脯氨酸可通過緩解對107楊非氣孔的限制，從而促進(jìn)PSⅡ在Cd脅迫下對CO2的吸收和利用，增加植物光能捕獲，提高光化學(xué)效率[29]，緩解Cd對光合作用的抑制作用.
表3 Cd、脯氨酸及其交互效應(yīng)對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
Table 3 Statistical significance of the single and interactive of Cd, proline on chlorophyII fluorescence parameters in leaves of P. × euramericana cv. ‘7476’
表3 Cd、脯氨酸及其交互效應(yīng)對107楊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的顯著性檢驗(yàn)
因子Fv∕FmΦPSⅡqPNPQ ETRc(脯氨酸)NSNSNSNSNSw(Cd)*****c(脯氨酸)×w(Cd)*******
注： *為P<0.05，表示差異顯著； ** 為P<0.01，表示差異非常顯著.
光合光響應(yīng)模型所獲得的光合生理參數(shù)是甄別植物光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)狀況、不同生境的光合能力及適應(yīng)規(guī)律的有效依據(jù)[30]. 該研究中，107楊葉片Pnmax、AQY和Rd均隨著Cd脅迫的加重而顯著降低，LCP顯著升高，表明Cd脅迫降低了107楊葉片在強(qiáng)光和弱光下的光合效率和光能利用能力，107楊通過減少呼吸作用的消耗來維持自身代謝平衡，對光強(qiáng)具有一定的適應(yīng)性，同時(shí)也可能是Cd脅迫限制了其生理活性，減少了對于能量的需求，這與鄭明瑜等[31]對Cd脅迫下煙草光合作用的研究結(jié)果一致. 在w(Cd)分別為100和200 mgkg條件下，外源添加c(脯氨酸)為10 mmolL時(shí)會使107楊葉片Pnmax分別提高46.61%和60.11%，說明外源脯氨酸處理可顯著緩解Cd脅迫對107楊葉片Pnmax的抑制作用. 此外，不同濃度Cd脅迫下，外源添加c(脯氨酸)為10 mmolL時(shí)均會不同程度地提高107楊葉片的AQY和Rd，降低LCP，說明外源脯氨酸處理可顯著提高Cd脅迫下107楊葉片光合效率和利用弱光的能力.
在活體狀態(tài)下，植物的葉綠素?zé)晒馊坑蒔SⅡ反應(yīng)中心產(chǎn)生[32]. PSⅡ原初反應(yīng)的FvFm和ΦPSⅡ是判斷植物是否受到光抑制的重要指標(biāo)，是研究植物對逆境脅迫響應(yīng)的理想?yún)?shù)[33-34]. 正常條件下，植物通常表現(xiàn)出較高的FvFm和ΦPSⅡ值，可以使植物獲得較高的光能轉(zhuǎn)化效率，從而有利于能量的同化積累[35]. 該研究中，w(Cd)為200 mgkg時(shí)，與對照組相比，107楊葉片F(xiàn)vFm和ΦPSⅡ分別下降12.41%和37.88%，說明107楊葉片的原初光化學(xué)效率和從天線色素到PSⅡ反應(yīng)中的傳能效率明顯受到Cd脅迫的影響，出現(xiàn)了光抑制現(xiàn)象. 同時(shí)，107楊葉片的qP和ETR也隨w(Cd)的升高而顯著降低，NPQ的變化規(guī)律則相反，這與甘龍等[36]對Cd脅迫下一年蓬(Erigeronannuus)葉綠素?zé)晒馓匦缘难芯拷Y(jié)果一致，說明Cd脅迫使107楊葉片的光合機(jī)構(gòu)受到一定程度的傷害，PSⅡ反應(yīng)中心氧化端電子傳遞受阻，光能轉(zhuǎn)化效率以及捕獲激發(fā)能的效率受到影響，用于熱耗散等非光化學(xué)反應(yīng)的能量增加.w(Cd)為200 mgkg時(shí)，與單獨(dú)Cd脅迫處理組相比，外源添加c(脯氨酸)為10和20 mmolL下107楊ETR顯著提高了63.26%和50.92%，并以c(脯氨酸)為10 mmolL處理時(shí)的效果更佳，表明外源脯氨酸處理緩解了Cd對反應(yīng)中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到一定程度的恢復(fù)，從而使植物能夠維持正常的暗反應(yīng)等基本生理功能.
4 結(jié)論
a) Cd脅迫對107楊光合相關(guān)生理過程的影響較為復(fù)雜. 在w(Cd)低于200 mgkg時(shí)，添加外源脯氨酸可有效促進(jìn)107楊的光合作用和提高水分利用效率，從而降低高濃度Cd脅迫對107楊光合作用的抑制，且以c(脯氨酸)為10 mmolL的效果較好；在w(Cd)為300 mgkg時(shí)，107楊的生長明顯受到抑制，外源脯氨酸處理雖能夠起到一定緩解作用，但作用較小.
b)w(Cd)低于200 mgkg時(shí)，添加外源脯氨酸能夠通過非氣孔限制來提高107楊葉片ΦPSⅡ、qP和ETR，緩解Cd對反應(yīng)中心活性的抑制作用，使光合電子鏈的傳遞速率得到一定程度的恢復(fù)，進(jìn)而緩解Cd脅迫對107楊的傷害，在礦區(qū)高濃度Cd污染地區(qū)的生態(tài)恢復(fù)中具有一定的應(yīng)用潛力.
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