基于NF-κB和Nrf2信號通路探討槲皮素的護肝功效及其作用機理

張紅娜，周玉法，劉敬博，龐全海

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學 生物科學與工程學院，石家莊 050061；2.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西太谷 030801； 3.泰安市岱岳區(qū)畜牧局，山東泰安 271000；4.山東農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山東泰安 271000)

肝臟作為重要的代謝器官，在機體的免疫防御、物質(zhì)代謝以及清除體內(nèi)毒物和藥物等方面起到至關(guān)重要的作用。毒素、酒精、病原微生物以及藥物等因素都可以造成肝臟功能障礙甚至是肝細胞壞死[1-2]。目前，隨著老齡化時代的到來，人們對藥物和保健品的需求也與日俱增，但藥物和保健品的盲目使用使得藥物性肝損傷的發(fā)生率隨之增加[3]。

藥物性肝損傷不僅給患者造成嚴重的健康威脅，而且也造成醫(yī)療資源的不必要浪費。在臨床上，由于藥物濫用造成的肝損傷已經(jīng)引起全球科研工作者的廣泛關(guān)注[4-7]。對乙酰氨基酚(Acetaminophen , APAP)，也稱撲熱息疼，過量或長期服用會加劇肝臟的氧化應(yīng)激并促進炎癥因子的過度釋放，導(dǎo)致肝功能紊亂甚至急性肝衰竭[8-9]。APAP造成的肝損傷在藥物性肝損傷中最為常見，具有較高的發(fā)病率和死亡率[10-11]。目前，針對APAP造成的肝損傷尚無有效藥物可用[12]。因此，開發(fā)有效治療APAP肝損傷的藥物顯得尤為必要。

槲皮素(Quercetin, QUE) 屬于黃酮醇類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化以及增強機體免疫力的功效[13]。以往的很多研究表明，QUE的護肝藥效與其良好的抑制促炎因子分泌和提高機體抗氧化能力密不可分，但具體的護肝機理有待深入研究[14-17]。本研究以APAP造成的藥物性肝損傷小鼠為動物模型，從抗炎和抗氧化兩個視角來探索其護肝機理。

1 材料與方法

1.1 試驗小鼠

選擇60只健康的BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量為(20±2) g，購于山東第一醫(yī)科大學實驗動物中心。在整個飼養(yǎng)過程中，12 h 明/暗交替，小鼠自由采食和飲水。

1.2 藥物、試劑和儀器

氧化還原指標檢測試劑盒和細胞因子檢測試劑盒由南京建成生物科技有限公司提供；Western-blot檢測所用抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；QUE和APAP由山東漱玉平民大藥房提供(純度>98%)；DSX500數(shù)碼顯微鏡(日本Olympus公司)；Stat4200型全自動酶標儀和高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。

1.3 動物分組及給藥

60只小鼠隨機等分為 4 組，包括試驗組(QUE低劑量干預(yù)組、QUE高劑量干預(yù)組和APAP肝損傷組)和對照組。根據(jù)小鼠體質(zhì)量，低、高QUE干預(yù)組連續(xù)7 d分別灌服50 mg/kg和100 mg/kg QUE溶液[二甲基亞砜(DMSO) 配制]，對照組和APAP肝損傷組灌服等量生理鹽水。第7 天灌服前禁食12 h，灌服完成1 h后，3個試驗組腹腔注射350 mg/kg APAP溶液(0.9%氯化鈉注射液配置)，對照組注射等量生理鹽水。

1.4 樣品收集和處理

腹腔注射完成24 h后，進行眼球采血，血液樣品靜置30 min后，4 000 r/min離心15 min，吸取上清為待測血清樣品。采血完成后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝臟，從肝左葉中部橫截面取樣品置于40 g/L多聚甲醛中固定，其余部分冷凍，備用。

1.5 組織病理學檢查

肝組織進行包埋、切片后，采用蘇木精和伊紅(H&E)進行染色處理，經(jīng)脫水、透明和中性樹膠封固后，置于光學顯微鏡下對切片進行圖像分析和采集。

1.6 血清生化指標以及細胞因子指標測定

取血清樣品，按照檢測試劑盒操作說明分別測定ALT和AST的活性以及TNF-α、IL-1β和IL-10的質(zhì)量濃度。

1.7 肝組織中氧化還原指標測定

將肝臟組織用預(yù)冷的PBS溶液進行研磨勻漿，離心后取上清液，然后按照氧化還原指標檢測試劑盒說明書檢測肝組織中SOD、GSH-Px的活性和MDA、GSH的質(zhì)量摩爾濃度。

1.8 Western-blot分析NF-κB p65和Nrf2的表達

提取的肝組織總蛋白用BCA檢測試劑盒測定總蛋白的質(zhì)量濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用50 g/L脫脂牛奶對轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的樣品封閉1 h，然后連續(xù)洗膜3次后，用一抗孵育過夜；再次洗滌3次后，用二抗在室溫條件下孵育30 min。最后發(fā)光顯影進行圖像采集并分析灰度值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用One-way analysis of variance(ANOVA)法進行統(tǒng)計分析(SPSS 15.0)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠存活率

經(jīng)腹腔注射APAP溶液或生理鹽水12 h后，對照組和QUE干預(yù)組的小鼠均未出現(xiàn)死亡，但APAP肝損傷組有2只小鼠在注射6～8 h后死亡。由此可見，QUE干預(yù)降低由APAP導(dǎo)致的小鼠死亡率。

2.2 肝組織的病理性損傷

由4組小鼠的完整肝臟(圖1)可看出，APAP肝損傷組的肝臟明顯腫大，顏色變深，且有黑色顆粒狀斑點；低劑量QUE干預(yù)組較APAP肝損傷組肝臟的顏色由黑紅色變淡，無明顯腫大；高劑量QUE干預(yù)組的肝臟外觀與對照組相似，表面有光澤且顏色較淺。

圖1 不同試驗條件下小鼠肝臟的外觀Fig.1 Characteristics of liver morphology under different experimental conditions

由H&E染色結(jié)果(圖2) 可知，與對照組相比， APAP組肝細胞出現(xiàn)損傷，肝小葉周圍發(fā)生炎性細胞浸潤，肝細胞核固縮現(xiàn)象明顯；低劑量QUE干預(yù)組小鼠肝臟的中央靜脈變性和壞死現(xiàn)象減輕，炎性細胞浸潤及細胞核固縮減少；高劑量QUE干預(yù)組與對照組肝細胞結(jié)構(gòu)較為相似，幾乎無變性及壞死現(xiàn)象。表明QUE改善APAP誘導(dǎo)的肝臟組織病理學變化，且具有量效特點。

圖2 H&E染色的小鼠肝組織病理切片(×200)Fig.2 Hematoxylin and eosin-stained liver section of mice from each group(×200)

2.3 QUE對APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中ALT和AST活性的影響

為評估QUE是否對APAP造成的肝損傷有緩解作用，分析小鼠血清中ALT和AST的活性。結(jié)果顯示，QUE干預(yù)組ALT和AST的活性較肝損傷組顯著下降，且具有量效特點(圖3)。

2.4 QUE對肝組織中氧化還原指標的影響

由圖4可知，QUE各劑量組SOD、GSH-Px的活性和GSH的濃度與肝損傷組相比都表現(xiàn)為上升趨勢，但MDA的質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)下降趨勢，且在高劑量QUE干預(yù)情況下差異極顯著 (P<0.01)。表明QUE能夠抑制APAP造成的氧化性肝損傷。

2.5 QUE對血清中炎癥因子的影響

與肝損傷組相比，不同劑量QUE干預(yù)組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的質(zhì)量濃度均降低，但IL-10顯著升高(圖5)。表明QUE不僅能抑制促炎因子的分泌，而且還能提高抑炎因子的表達水平，具有良好的抗炎功效，且與劑量有一定的相 關(guān)性。

與對照組相比：**P<0.01；與APAP組相比： #P<0.05、##P<0.01。下同 **P<0.01 vs control group; ##P< 0.01, #P<0.05 vs APAP model group, the same below

2.6 Western-blot分析NF-κB p65和Nrf2的表達變化

通過Western-blot檢測QUE和APAP對肝臟中NF-κB p65和Nrf2蛋白表達的影響，探索QUE的護肝通路。由圖6-A看出，與對照組相比，APAP誘導(dǎo)的肝損傷引起NF-κB p65蛋白表達明顯上升，Nrf2蛋白明顯下降。蛋白表達條帶的灰度值(圖6-B和6-C)可清晰顯示，與APAP組相比，高、低劑量的QUE干預(yù)顯著降低NF-κB p65蛋白的表達水平，顯著上調(diào)Nrf2蛋白的表達水平，且高劑量QUE組表現(xiàn)為差異極顯著。表明QUE發(fā)揮護肝功效與其有效抑制NF-κB信號通路，減少促炎癥因子的產(chǎn)生，以及促進Nrf2信號通路，增強機體的抗氧化能力密切相關(guān)(圖7)。

圖4 肝組織中SOD、GSH-Px、GSH及MDA水平Fig.4 Level of SOD, GSH-Px, GSH, and MDA in

圖5 血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度 Fig.5 Mass fraction of inflammatory factors in

圖6 肝組織中NF-κB p65和Nrf2的蛋白表達水平Fig.6 NF-κB p65 and Nrf2 protein expression levels in

圖7 槲皮素緩解APAP造成肝損傷的可能機理圖Fig.7 Potential mechanism of quercetin for alleviating liver injury induced by APAP

3 討 論

血清中ALT和AST活性被公認為是診斷肝臟毒性或肝損傷的重要參考生化指標[18]。本研究中，腹腔注射APAP后，小鼠血清中ALT和AST的活性顯著升高，肝組織病理切片檢測結(jié)果顯示肝細胞出現(xiàn)變性甚至壞死以及炎性細胞浸潤等，說明本研究中藥物性肝損傷小鼠模型建立成功。不同劑量QUE干預(yù)處理均能明顯降低APAP誘導(dǎo)的血清中ALT和AST的活性，減輕APAP引起的病理組織學變化。表明QUE對APAP造成的藥物性肝損傷有一定的保護作用。

APAP過量導(dǎo)致氧化應(yīng)激是小鼠肝損傷的重要原因[19]。為進一步證實QUE通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮護肝效應(yīng)。本研究檢測了氧化應(yīng)激相關(guān)參數(shù)，包括MDA、GSH-Px、GSH和SOD。MDA作為脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，用來評估氧化應(yīng)激的程度[20]。抗氧化劑SOD和活性氧清除劑GSH不僅可與自由基、超氧離子等結(jié)合，而且可將其催化為無害的物質(zhì)，使細胞免受氧化損傷[21]。本研究中過量的APAP會通過降低GSH的濃度、降低GSH-Px和SOD的活性，以及增加MDA的質(zhì)量摩爾濃度引起肝細胞氧化應(yīng)激，而QUE干預(yù)處理明顯降低肝組織中SOD、GSH-Px的活性和GSH濃度，抑制MDA質(zhì)量摩爾濃度的增加，且呈劑量依賴性。表明QUE可通過抗氧化活性減少肝臟的氧化應(yīng)激損傷。

本研究中，QUE干預(yù)處理可顯著下調(diào)APAP肝損傷組小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的質(zhì)量濃度，顯著上調(diào)抑炎因子IL-10的表達，且與劑量有一定的相關(guān)性。表明QUE可通過抗炎活性來緩解APAP誘導(dǎo)所致的藥物性肝損傷。

NF-κB p65和Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子，分別在調(diào)控炎性細胞因子表達和機體氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[22-25]。本研究利用Western-blot分析NF-κB p65、Nrf2轉(zhuǎn)錄因子在小鼠肝細胞中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，APAP可誘導(dǎo)NF-κB p65蛋白的表達水平顯著升高，QUE干預(yù)處理可使該蛋白表達顯著下調(diào)，且與劑量有相關(guān)性，說明QUE可通過抑制APAP引發(fā)的炎癥反應(yīng)緩解肝損傷，從而發(fā)揮護肝功效。與對照組相比，APAP組小鼠肝細胞中Nrf2蛋白表達顯著下降，而QUE干預(yù)組顯著上調(diào)，表明QUE可通過激活Nrf2通路提高抗氧化因子的表達，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激起到護肝效果。由此推測，QUE的護肝功效不僅與激活Nrf2信號通路，加強機體的抗氧化應(yīng)激水平相關(guān)，而且與抑制NF-κB 信號通路，降低促炎因子釋放密切相關(guān)。

本研究結(jié)果證實QUE能有效緩解APAP造成的藥物性肝損傷，在對APAP造成的藥物性肝損傷中發(fā)揮抗炎和抗氧化的護肝機理是分別通過調(diào)控NF-κB和Nrf2信號通路來實現(xiàn)，且呈現(xiàn)出量效特點。