DON暴露對斷奶仔豬小腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌及鈣穩(wěn)態(tài)的影響

朱 雷，曹 利，冉 夢，王中正,2， 陳曉芳，李 玉，馮士彬，吳金節(jié)，王希春

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，合肥 230036；2. 安徽省銅陵市農(nóng)業(yè)委員會，安徽銅陵 244000)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，又名嘔吐毒素，主要是由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種B型單端孢霉烯[1]。據(jù)檢測報告數(shù)據(jù)顯示，2017年國內(nèi)各省市區(qū)域的玉米、玉米副產(chǎn)物全價飼料等1 034個飼料原料及配合飼料樣品的DON超標(biāo)率分別達(dá)到1.23%、6.67%及1.76%[2]。在另一調(diào)查中，全國21個省市檢測的659份飼料及飼料原料樣品中，霉菌毒素污染水平呈現(xiàn)出區(qū)域差異，整體受DON毒素污染最為嚴(yán)重[3]。以往的研究結(jié)果表明，DON對動物機(jī)體具有免疫毒性、神經(jīng)毒性及細(xì)胞毒性等多種毒性作用[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DON暴露可以影響雛雞腦部的脂質(zhì)過氧化水平，神經(jīng)遞質(zhì)分泌以及擾亂鈣穩(wěn)態(tài)的平衡，此外，DON還可以改變雛雞腦部的形態(tài)結(jié)構(gòu)[5-7]。另外其他研究表明，DON還可以影響體外培養(yǎng)仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)分泌、改變脂質(zhì)過氧化及鈣穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)[8-9]。低水平的DON可以影響豬腦脊髓液中多巴胺的濃度[10]，而高水平DON則可使初產(chǎn)豬皮質(zhì)中5-羥色胺及下丘腦多巴胺濃度增加，同時減少下丘腦中去甲腎上腺素及腦橋中多巴胺的含量[11]。在小腦神經(jīng)研究方面，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DON可使斷奶仔豬小腦的部分神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常[12]。目前，關(guān)于飼料中DON對斷奶仔豬神經(jīng)毒性的研究大多集中在大腦組織及神經(jīng)細(xì)胞的體外毒性方面，對小腦組織的研究較少。因此，本研究旨在通過斷奶仔豬DON體內(nèi)暴露試驗，探索其對仔豬小腦組織的毒性作用，為進(jìn)一步豐富和完善DON的神經(jīng)毒性機(jī)理提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，由安徽省青陽縣五星畜牧種豬場提供。

1.2 主要試劑和儀器

禾谷鐮刀菌菌種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中毒病實驗室惠贈；多咪靜注射液，購自美國輝瑞制藥有限公司；ELISA試劑盒，均購自上海源葉生物科技有限公司；Ca2+測定試劑盒，購自北京利德曼生化股份有限公司；RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)研究所；β-actin抗體，購自北京銳抗生物科技有限公司；Calmodulin(CaM)、CaMKⅡ、CaMKⅡ(Phospho Thr305)抗體，均購自美國ImmunoWay；二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol RNA 提取試劑，購自大連寶生物工程有限公司；StarScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Mix，購自北京康潤誠業(yè)生物技術(shù)有限公司(GenStar)；SybrGreen q-PCR mastermix，購自廣州柏仕達(dá)新材料有限公司；PierceTMECL Western-blot Substrate，購自美國Thermo有限公司。

1.3 試驗動物的分組與飼養(yǎng)管理

選取15頭21日齡平均體質(zhì)量為(6.87± 0.41)kg的臨床檢查健康的“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為3欄，每欄5頭，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、低劑量DON飼糧(DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mg·kg-1)、高劑量DON飼糧(DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg·kg-1)。試驗期為60 d。自由采食，自由飲水，每天觀察仔豬的采食和健康狀況，消毒免疫程序嚴(yán)格按照豬場管理方案進(jìn)行。

1.4 樣品采集與處理

在第60天時，每欄選5頭仔豬，麻醉后經(jīng)前腔靜脈放血致死，仔細(xì)剝離頭骨并迅速取出完整的腦，并置于冰上分離出小腦組織。取部分小腦組織加入一定量生理鹽水，置于冰上進(jìn)行勻漿， 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于 -80 ℃冰箱內(nèi)，用以檢測脂質(zhì)過氧化指標(biāo)、神經(jīng)遞質(zhì)含量及Ca2+濃度；剩余部分組織裝入凍存管，保存于液氮，用以檢測鈣調(diào)蛋白通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況。

1.5 檢測指標(biāo)和方法

1.5.1 氧化與抗氧化性能指標(biāo)的測定 分別用豬超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒進(jìn)行測定，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 神經(jīng)遞質(zhì)及鈣離子濃度的測定 分別用豬5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、乙酰膽堿(ACH)和γ-氨基丁酸(GABA)ELISA檢測試劑盒及Ca2+測定試劑盒進(jìn)行測定，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3 qRT-PCR 法檢測組織中CaM和CaMKⅡmRNA基因相對表達(dá)水平 將組織樣本分別用液氮研磨粉碎，加入 1 mL Trizol試劑，在碎冰上進(jìn)行勻漿處理，離心取上清液，加入500 μL酚氯仿，振蕩混勻，靜止5 min，置于離心機(jī)中，4 ℃離心10 min，取上清并加入700 μL異丙醇，混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，去上清，取白色沉淀，用φ=75%乙醇洗滌1次，置于超凈臺上風(fēng)干，溶于50 μL DEPC處理水中，電泳檢測。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù)GenBank中序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計目的基因和內(nèi)參基因的特異性上、下游引物序列。相關(guān)基因的引物序列見表1。

表1 CaM、 CaMKⅡ 目的基因和 18S內(nèi)參基因引物參數(shù)Table 1 Parameters of primer for CaM, CaMKⅡ and 18S genes

1.5.4 Western-blot法檢測組織中鈣調(diào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 稱取0.1 g凍存的小腦組織，加入1 mL RIPA裂解液，14 000 r·min-1離心10 min收集上清，備用。收集的上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照每孔蛋白總量為50 μg計算蛋白上樣量，分裝后的蛋白加入Loading Buffer(5×)，100 ℃水浴 5 min，存于4 ℃，備用。安裝膠板，配12%的分離膠及15%的濃縮膠，加樣后將電壓調(diào)至80 V開始電泳，待樣品跑至兩膠分界線時將電壓調(diào)至120 V，待樣品跑至膠板底部時終止電泳。隨后切下所需凝膠將條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將印有蛋白的膜置于50 g·L-1的脫脂牛奶中，置于水平搖床上室溫孵育 4 h進(jìn)行封閉。隨后4 ℃孵育一抗過夜。次日TBST清洗后，室溫孵育二抗 45 min，TBST清洗后滴加顯影液使用凝膠成像系統(tǒng)成像，并用Quantity one軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 20.0軟件中的ANOVA過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用LSD法；使用Adobe Photoshop CS4軟件合成圖片；柱形圖使用GraphPad Prism 5.0 軟件 制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬小腦組織中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的檢測

由表2可見，與對照組相比，高劑量組SOD活性極顯著降低(P<0.01)，與低劑量組相比，高劑量組SOD活性顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，試驗組的GSH-Px活性均極顯著降低 (P<0.01)，且高劑量組極顯著低于低劑量組 (P<0.01)。與對照組相比，試驗組的NO濃度均極顯著升高(P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組NO濃度極顯著升高(P<0.01)。各組間MDA濃度無顯著差異(P>0.05)。

表2 DON對小腦中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)活性的影響Table 2 Effect of DON on activities of lipid peroxidation indexes in cerebellum

注：同行進(jìn)行相比，數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著但未達(dá)極顯著(0.010.05)。下同。

Note: In the same row of the different groups,the data with different superscripts of uppercase letters indicate significance atP<0.01,the data with different superscripts of lowercase letters indicate significance at 0.01

2.2 斷奶仔豬小腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)及Ca2+濃度的檢測

由表3可知，與對照組相比，高劑量組5-HT濃度極顯著升高(P<0.01)，且高劑量組顯著高于低劑量組(P<0.05)。各組間NE和GABA濃度無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比，試驗組DA含量均極顯著降低且呈劑量依賴型(P<0.01)。與對照組相比，試驗組ACH含量均極顯著降低(P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組ACH含量極顯著降低(P<0.01)。與對照組相比，試驗組鈣離子濃度均極顯著上升(P< 0.01)；與低劑量組相比，高劑量組鈣離子濃度呈極顯著上升(P<0.01)。

表3 DON對小腦中神經(jīng)遞質(zhì)及Ca2+濃度的影響Table 3 Effect of DON on concentrations of neurotransmitters and Ca2+ in cerebellum

2.3 仔豬小腦組織中鈣調(diào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖1可知，高劑量組CaMmRNA表達(dá)量極顯著低于對照組和低劑量組(P<0.01)。與對照組相比，隨飼糧中DON含量的增加，仔豬小腦中CaMKⅡmRNA基因相對表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)。

2.4 DON對仔豬小腦組織中鈣調(diào)通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響

如圖2所示，高劑量組CaM蛋白水平極顯著低于對照組和低劑量組(P<0.01)，而高劑量組CaMKⅡ蛋白磷酸化水平極顯著高于對照組和低劑量組(P<0.01)。對照組與低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 DON對小腦中CaM和 CaMKⅡ mRNA 相對表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of DON on relative expression of CaM and CaMKⅡ mRNA in cerebellum

C為對照組 C is control group；L為低劑量組 L is low dose group；H為高劑量組 H is high dose group

3 結(jié)論與討論

玉米為仔豬飼料中的重要成分之一，飼糧一旦保存不當(dāng)，如遇到潮濕、高溫等環(huán)境，則極易產(chǎn)生DON。研究表明，DON對動物具有神經(jīng)及細(xì)胞毒性作用，可使雛雞腦組織[7]及體外培養(yǎng)的仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞[9]發(fā)生脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞損傷，本試驗使用的斷奶仔豬飼糧中DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 mg·kg-1，該質(zhì)量分?jǐn)?shù)為國家標(biāo)準(zhǔn)中的最高限量，將其作為試驗低劑量組進(jìn)行DON對斷奶仔豬小腦組織和細(xì)胞損傷作用的研究。

當(dāng)動物出現(xiàn)氧化應(yīng)激時，機(jī)體產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷的促氧化劑，與此同時，機(jī)體也將產(chǎn)生相應(yīng)的抗氧化劑進(jìn)行平衡，如SOD、GSH-Px等[13]。此外，NO也可通過細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化作用從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷，若NO含量過多最終會造成腦損傷[14]。本試驗中所檢測的MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，綜合以上指標(biāo)可說明機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度。研究表明，DON可使仔豬海馬細(xì)胞中SOD及GSH-Px含量顯著降低，而使MDA的含量極顯著升高[9]。此外，3 mg·kg-1DON可使斷奶仔豬血清中GSH-Px含量顯著降低[15]。在本試驗中，DON使斷奶仔豬小腦組織中GSH-Px及SOD顯著下降，而NO及MDA顯著升高，說明DON誘導(dǎo)仔豬小腦組織出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，并對腦組織細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性作用。

神經(jīng)遞質(zhì)為動物機(jī)體中傳導(dǎo)神經(jīng)沖動的重要物質(zhì)。其中ACH尤為重要，它可在突觸間進(jìn)行傳遞，傳導(dǎo)神經(jīng)沖動。有研究顯示，ACH在低濃度時，神經(jīng)間的興奮傳遞被抑制，神經(jīng)細(xì)胞的生長和分化均受到影響，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育遲緩[16]。此外，DON導(dǎo)致動物產(chǎn)生嘔吐反應(yīng)，可能是由于其作用在腸嗜鉻細(xì)胞(EC)細(xì)胞而誘導(dǎo)5-HT的局部釋放[17]。NE則對急性應(yīng)激反應(yīng)具有快速的反應(yīng)，是交感神經(jīng)腎上腺素的核心組成成分[18]。已有學(xué)者研究表明，DON可使豬下丘腦、額葉和小腦中引起NE及5-HT的增加和DA的減少[12]。同時還可使豬血清及腦部5-HT濃度的升高從而改變豬的攝食行為并出現(xiàn)拒食和嘔吐現(xiàn)象[19-20]。本試驗中斷奶仔豬小腦組織中5-HT含量顯著升高，而DA、ACH含量下降，說明DON影響仔豬小腦組織中各種神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，對小腦的神經(jīng)傳導(dǎo)產(chǎn)生一定影響，而NE并未出現(xiàn)顯著變化，說明長期飼喂含DON飼糧對斷奶仔豬機(jī)體產(chǎn)生慢性毒性作用而非急性。

在動物機(jī)體中，Ca2+是一種非常重要的物質(zhì)，它可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。作為Ca2+釋放傳感器的CaM在腦中含量豐富[21]，過氧化氫酶(CAT)、SOD及大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程均是受Ca2+與CaM結(jié)合所調(diào)控[22]。但Ca2+濃度較高則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死[23]。此外，CaMKⅡ是一種多聚體絲氨酸—蘇氨酸激酶，為神經(jīng)遞質(zhì)釋放的必需物質(zhì)[24]，其最初通過結(jié)合鈣化鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)激活，該蛋白質(zhì)的磷酸化則有助于確定細(xì)胞膜的興奮性及細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)[25]。研究表明，DON可使體外培養(yǎng)的仔豬海馬細(xì)胞中Ca2+含量極顯著升高[9]。本試驗中，試驗組斷奶仔豬小腦組織中Ca2+含量上升，但CaM基因及蛋白的表達(dá)量均降低，同時CaMKⅡ磷酸化程度升高導(dǎo)致其基因與蛋白含量降低，說明DON對小腦的鈣穩(wěn)態(tài)造成一定程度的影響，具有一定的神經(jīng)毒性作用。

綜上所述，通過體內(nèi)暴露試驗，DON可影響斷奶仔豬小腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，同時擾亂鈣調(diào)通路相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)水平，引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡。上述結(jié)果表明 DON可對仔豬產(chǎn)生一定的神經(jīng)毒性作用。