合作豬IFN-ε基因克隆及生物信息學分析

楊姣姣，謝開會，王 偉，閆尊強 ，楊巧麗，馬艷萍，滾雙寶，

(1.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，蘭州 730070； 2.甘肅農業(yè)大學 圖書館，蘭州 730070； 3.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術研究中心，蘭州 730070)

干擾素(Interferon，IFN)是由瑞士研究人員Jean-Lindenmann和英國病毒生物學家Alick Isaacs在1957年利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時，發(fā)現(xiàn)的一種具有多種生物活性的糖蛋白[1]。依據(jù)結構和來源的不同，IFN可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[2]，不同類型的干擾素具有相似的功能，如抗病毒、調控細胞分裂與增殖及介導機體免疫反應等[3]。IFN-ε是Ⅰ型干擾素重要成員之一，與IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ν等具有相同的基因座位點、受體類型及相似的蛋白結構[4-6]。與其他Ⅰ型干擾素不同，IFN-ε表達于多種細胞，如冠狀動脈平滑肌細胞、微血管內皮細胞和支氣管上皮細胞[7]；此外，IFN-ε也具有抵抗病毒的活性[8]，在胎生哺乳動物早期胎盤發(fā)育過程中有重要保護作用[9-11]，研究還發(fā)現(xiàn)IFN-ε能保護女性生殖系統(tǒng)免受病毒和細菌的感染[9]。Fischer等[12]發(fā)現(xiàn)，IFN-ε在馬子宮內膜組成性表達，是子宮內膜固有免疫系統(tǒng)的一部分，能防止病毒感染子宮。Demers等[13]發(fā)現(xiàn)，IFN-ε可能是抵抗粘膜病原體入侵的第一道防線。研究報道，IFN-ε已被證明可以預防人上皮細胞和T細胞感染艾滋病毒(HIV)[14]。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)，重組犬IFN-ε與犬惡性腫瘤細胞A72共孵育時，有50%的腫瘤細胞生長受到抑制。目前，干擾素制劑作為一種新型生物制劑，在疾病預防和控制方面發(fā)揮著重要功能。合作豬是世界上少有的珍稀高原型豬種，甘肅合作為中心產區(qū)，地理隔離及獨特的高原氣候，使合作豬保存了獨特的遺傳結構和遺傳性狀[16]。作為小型原始地方品種，合作豬具有體型矮小、適應性和抗病性強等特點，是開展相關疾病研究的理想實驗動物模型，具有廣闊的應用前景[17]。近年來，人們對IFN-ε研究日益增加，Hardy等[4]發(fā)現(xiàn)，小鼠IFN-ε長度為664bp，編碼192個氨基酸；人IFN-ε長度為642bp，編碼208個氨基酸。王庭柱等[18]發(fā)現(xiàn)，牛IFN-ε編碼193個氨基酸，牛IFN-ε蛋白具有典型的Ⅰ型干擾分子特征。犬IFN-ε基因編碼208個氨基酸，其編碼蛋白N端前21個氨基酸殘基為信號肽[15]。有關豬IFN-ε的研究也有報道，如研究人員利用大白和長白二元雜交豬胃組織，成功克隆得到其IFN-ε基因序列[19]。然而迄今為止，鮮有合作豬IFN-ε基因克隆及生物信息學分析的報道。因此，本試驗對合作豬IFN-ε進行克隆及生物信息學分析，以期為進一步研究合作豬IFN-ε生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品 取健康合作豬(甘肅省甘南藏族自治州合作市)耳組織，液氮速凍后于-80 ℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑 Trizol購自Invitrogen(美國)。pMD19-T Vector(6013)、反轉錄試劑盒(6210A)均購自寶生物工程 (大連) 有限公司。 2×TaqMaster Mix(KT211-01)，DH5α感受態(tài)細胞(CB101-02)，膠回收試劑盒(DP209-02)，一次性培養(yǎng)皿均購自天根生化科技(北京)有限公司。瓊脂粉，氨芐青霉素，酵母提取物，胰蛋白胨購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 合作豬IFN-ε基因引物設計與合成 下載GenBank中豬IFN-ε基因序列(登錄號為NM_001105310.1)，利用Premier 5.0軟件設計引物，預期擴增長度為586 bp，包含582 bp的編碼區(qū)，引物序列IFN-ε-F:5′- CACCATGATCAACAAGTCTTTC-3′和IFN-ε-R:5′-TCAAGGTTCCATTCCTTGTTT-3′，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 合作豬RNA提取與cDNA合成 用Trizol提取合作豬耳組織總RNA。用微量紫外可見分光光度計(NanoDrop 2000)測定RNA濃度和純度，用反轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄，反轉錄體系10 μL：RNA 0.8 μL，Oligo dt Primer 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase-Free Water 7.2 μL。將10 μL反轉錄體系于65 ℃的水浴作用5 min，取出置于0 ℃的冰上，再加入如下體系：5× Prime Script Ⅱ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime Script Ⅱ RTase 1 μL，RNase-Free H2O 4.5 μL。將上述總體系20 μL的溶液置于48 ℃金屬浴中，反應 1 h，95 ℃滅活5 min即可得到cDNA，-20 ℃保存，待用。

1.2.3 合作豬IFN-ε基因PCR擴增 反應體系(總體積為20 μL)：上、下游引物各0.5 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free H2O 7 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，按照天根DP209-02凝膠回收試劑盒的操作說明書，對目的片段進行回收純化。

1.2.4 合作豬IFN-ε基因克隆與測序 將PCR擴增產物回收純化后，通過TA克隆方法將該序列在16 ℃連接至pMD19-T載體，轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂板于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，進行藍白斑篩選，用PCR法進行菌落鑒定，選取陽性菌液送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.2.5 合作豬IFN-ε基因序列生物信息學分析 利用DNAMAN和Mega 5.0進行同源性比對和系統(tǒng)進化樹構建；通過在線軟件Protaram(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質基本理化性質；通過在線軟件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白質跨膜結構；通過在線軟件SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白信號肽；通過在線軟件ExPASy服務器中Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質的親疏水性；通過POSORT Ⅱ Prediction在線網站(https://psort.hgc.jp/form2.html)預測蛋白質的亞細胞定位；通過NCBI網站的CDD在線工具預測基因編碼蛋白保守結構域；通過在線軟件Prabi服務器的SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)預測蛋白質二級結構；通過在線軟件SWISS-MODEL(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)預測蛋白質三級結構。

2 結果與分析

2.1 合作豬IFN-ε基因克隆

以合作豬耳組織cDNA為模板，PCR擴增IFN-ε基因CDS區(qū)域，產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)1條長約586 bp的條帶(圖1)，與預期片段大小一致，說明成功獲得合作豬IFN-ε基因CDS區(qū)域。

M.2000 DNA marker；1.IFN-ε基因PCR擴增產物 PCR product ofIFN-εgene；2.陰性對照 Negative control

圖1 合作豬IFN-ε基因PCR擴增產物
Fig.1 PCR amplification product ofIFN-εgene in Hezuo pig

2.2 合作豬IFN-ε基因序列測序及分析

測序結果顯示，合作豬IFN-ε基因CDS區(qū)長582 bp，編碼193個氨基酸(圖2)。同源性比對結果發(fā)現(xiàn)，合作豬IFN-ε基因編碼序列與杜洛克豬(Duroc，NM_001105310.1)、小鼠(Musmusculus，NM_177348.2)、人(Homosapiens，NM_176891.4)、黑猩猩(Pantroglodytes，XM_528573.4)、犬(Canislupusfamiliaris，XM_022425479.1)、瘤牛(Bosindicus，XM_019965656.1)、蒙古野馬(Equusprzewalski，XM_008531931.1)、山羊(Caprahircus，XM_013965868.2)和綿羊(Ovisaries，XM_012127127.2)的序列同源性分別為98.4%、 56.8%、77.7%、78.2%、76.5%、87.0%、85.5%、 85.0%和86.0%(表1)。采用MEGA5.0中的N-J方法構建物種系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)合作豬與杜洛克豬的親緣關系最近，與瘤牛、蒙古野馬、綿羊、山羊親緣關系較近，與小鼠親緣關系最遠(圖3)。

圖2 合作豬IFN-ε基因CDS區(qū)和編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and amino sequence of IFN-ε gene CDS region in Hezuo pig

2.3 合作豬與杜洛克豬IFN-ε基因CDS序列和氨基酸序列比對

合作豬與豬參考基因組IFN-ε基因(登錄號：NM_001105310.1)CDS序列比對結果表明，合作豬IFN-ε基因CDS序列存在3個堿基突變，均為錯義突變，86 bp處C突變?yōu)門導致第29位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?99 bp處A突變?yōu)镚導致第67位甲硫氨酸突變?yōu)槔i氨酸，406 bp處T突變?yōu)镚導致第136位半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼?圖4)。

2.4 合作豬IFN-ε蛋白理化性質分析

ProtParam在線服務器分析結果顯示，合作豬IFN-ε蛋白由193個氨基酸殘基組成(表2)，分子式為C1027H1630N278O290S10，分子質量為 22.83 ku，理論等電點為8.43，說明該蛋白為堿性蛋白。肽鏈N端為蛋氨酸(Met)，在體外的理論半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為47.17，屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為99.48，平均親水系數(shù)為 -0.240，屬于親水蛋白。

表1 IFN-ε基因CDS同源性比較Table 1 Comparison of CDS homology of IFN-ε gene %

圖3 IFN-ε基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IFN-ε gene

圖4 合作豬與杜洛克豬IFN-ε基因編碼氨基酸序列比對結果Fig.4 Sequence comparison result of IFN-ε gene amino acid between Hezuo pig and Duroc

表2 合作豬IFN-ε蛋白氨基酸組成
Table 2 Composition of amino acids inIFN-εprotein of Hezuo pig

氨基酸Amino acids數(shù)量Number頻率/%Frequency氨基酸Amino acids數(shù)量Number頻率/%FrequencyAla(A)73.6Lys(K)115.7Arg(R)115.7Met(M)73.6Asn(N)84.1Phe(F)126.2Asp(D)42.1Pro(P)42.1Cys(C)31.6Ser(S)168.3Gln(Q)2110.9Thr(T)63.1Glu(E)168.3Trp(W)21Gly(G)52.6Tyr(Y)52.6His(H)52.6Val(V)105.2Ile(I)94.7Pyl(O)00Leu(L)3116.1Sec(U)00

2.5 合作豬IFN-ε蛋白疏水性分析

運用ExPASy服務器中ProtScale程序對合作豬IFN-ε蛋白做疏水性分析發(fā)現(xiàn)，其中第10位甲硫氨酸(Met)疏水性最強(分值為2.678)，第72位酪氨酸(Tyr)疏水性最弱(分值為-3.056)，在負值區(qū)域有較多氨基酸(圖5)，這與Protaram預測結果一致。

2.6 合作豬IFN-ε蛋白二級結構和三級結構預測分析

合作豬IFN-ε蛋白二級結構預測表明，此蛋白中α-螺旋占61.66%，無規(guī)則卷曲占30.05%，β-轉角占3.11%，延伸鏈占5.18%(圖6)。通過SWISS-MODEL平臺對合作豬IFN-ε蛋白建模預測三級結構發(fā)現(xiàn)，IFN-ε蛋白以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主(圖7)。

圖5 合作豬IFN-ε蛋白的疏水性預測結果Fig.5 Prediction of hydrophobicity of IFN-ε protein in Hezuo pig

h.α-螺旋 Stands for alpha-helix；e.延伸鏈 Epresents extended chain；c.無規(guī)則卷曲 Stands for irregular curling；t.β-轉角 Trefers to beta-angle of rotation

圖6 合作豬IFN-ε蛋白二級結構預測
Fig.6 Secondary structure of IFN-ε protein in Hezuo pig

圖7 合作豬IFN-ε蛋白三級結構預測Fig.7 Tertiary structureof IFN-ε protein in Hezuo pig

2.7 合作豬IFN-ε蛋白跨膜結構預測及信號肽分析

運用TMHMM對合作豬IFN-ε蛋白跨膜結構進行分析，預測結果表明IFN-ε蛋白不存在跨膜結構(圖8)。使用SignalP 4.1軟件預測蛋白信號肽發(fā)現(xiàn)，合作豬IFN-ε蛋白具有信號肽，綜合考慮S值、C值、Y值的得分發(fā)現(xiàn)，其信號肽位于第1至第21位氨基酸殘基之間(圖9)，說明該蛋白為分泌型蛋白。

2.8 合作豬IFN-ε蛋白的亞細胞定位分析

運用PSORT中k-NN計算程序預測合作豬IFN-ε蛋白亞細胞分布可能情況為：細胞質(cytoplasmic)11.1%、細胞核(nuclear)11.1%、線粒體(mitochondrial)11.1%、質膜(plasma membrane)22.2%、細胞外(extracellular,including cell wall)33.3%、液泡(vacuolar)11.1%，說明IFN-ε蛋白主要分布于細胞外。

圖8 合作豬IFN-ε蛋白跨膜結構Fig.8 Transmembrane structure of IFN-ε protein in Hezuo pig

圖9 合作豬IFN-ε蛋白信號肽預測Fig.9 Predicted result of IFN-ε protein signal peptide in Hezuo pig

2.9 合作豬IFN-ε蛋白的保守結構域預測

運用NCBI的CDD在線工具來預測合作豬IFN-ε蛋白保守結構域。結果顯示，合作豬IFN-ε蛋白只含有1個超家族保守結構域，即IFab超家族，位于29～186位氨基酸殘基(圖10)。

圖10 合作豬IFN-ε蛋白保守結構域預測Fig.10 Conserved domain prediction of IFN-ε protein in Hezuo pig

3 討 論

干擾素目前被確認為機體防御廣譜的病毒性疾病的第一道防線[20-22]，而Ⅰ型干擾素是先天性免疫和適應性免疫的核心[23]。Ⅰ型干擾素 IFN-α己經被廣泛應用于臨床治療，但神經抑郁是其普遍的副作用[24]；人IFN-ε具有部分IFN-α的功能，還具有維護腦神經正常等功能，有望成為IFN-α不良反應嚴重患者的替代藥品[25]；此外，IFN-ε在胎生哺乳動物早期胎盤發(fā)育過程中有重要作用[9-11]。近年來，人、鼠、犬、牛等物種IFN-ε相繼被成功克隆[4,15,18]。本試驗克隆獲得合作豬IFN-ε基因的完整編碼序列，全長582 bp，編碼193個氨基酸，與臺玉磊等人研究結果一致[19]。核苷酸序列對比結果發(fā)現(xiàn)，合作豬IFN-ε基因編碼序列與杜洛克豬IFN-ε基因編碼序列同源性高達98.4%，與羊、牛等哺乳動物同源性達到80%以上，而與小鼠的同源性僅為56.8%，這說明在近緣物種間IFN-ε具有較高的保守性；系統(tǒng)進化樹結果也表明，合作豬與杜洛克豬的遺傳距離最近，與小鼠遺傳距離最遠，進一步說明干擾素具有相對種屬特異性。研究報道，大白長白二元雜交豬IFN-ε基因與小鼠IFN-ε基因同源性較差，符合物種間的親緣關系[19]，與本研究結果類似。基因編碼區(qū)堿基突變，可能引起基因編碼蛋白序列、結構和功能發(fā)生變化[25]。李莉莉等[26]發(fā)現(xiàn)，IFN-ε 155位半胱氨酸突變成絲氨酸后，重組人干擾素突變樣品回收率明顯高于未突變樣品，但氨基酸突變后對重組人干擾素抗病毒活性沒有明顯影響。與杜洛克豬相比，合作豬IFN-ε基因CDS序列存在3個堿基突變，從而引起3個氨基酸突變，說明合作豬與杜洛克豬IFN-ε基因可能存在某些生物功能上的差異，這些差異是否影響豬的抗病性強弱還需今后進行深入研究分析。

合作豬IFN-ε蛋白不存在跨膜結構，說明其不是跨膜蛋白，但存在信號肽序列，表明該蛋白是分泌型蛋白，能在細胞外起作用，這與亞細胞定位預測結果一致。研究報道，人[7]，犬[15]，牛[18]，大白長白二元雜交豬[19]IFN-ε蛋白均存在信號肽序列，且它們的蛋白編碼序列N端前21個氨基酸為信號肽，與本研究結果一致。研究發(fā)現(xiàn)，一般情況下，新生蛋白通常在位于其N端的信號肽的指引下到達細胞特定區(qū)域，并由其介導進行跨膜轉運[27]，干擾素產生后必須與細胞膜上的特異性受體結合才能發(fā)揮其功能[28]，合作豬IFN-ε蛋白信號肽的存在，對保證其發(fā)揮正常功能有重要意義。蛋白質半衰期與其穩(wěn)定性之間存在密切聯(lián)系，一般來說，半衰期長則蛋白質穩(wěn)定性高[29]。有研究報道，蛋白質N端氨基酸序列與蛋白質穩(wěn)定性具有很強的相關性，有近80%的短壽命蛋白含有信號肽[30]。本研究結果顯示，IFN-ε蛋白具有較長的半衰期，卻屬于不穩(wěn)定蛋白，這可能與合作豬IFN-ε蛋白存在信號肽有關。相對于IFN-ε蛋白中間氨基酸序列來說，其兩端的氨基酸序列保守性較差，進一步分析發(fā)現(xiàn)，其中間氨基酸序列有一個保守結構域IFab。IFab結構域屬于較大螺旋細胞因子超家族，包括生長激素、白細胞介素、若干集落刺激因子和若干其他調節(jié)分子，通過與細胞表面受體相互作用調節(jié)細胞活性，激活各種信號通路，能夠參與抗病毒和抗增殖反應[31]。IFN通過與細胞表面受體IFNAR1和IFNAR2結合發(fā)揮其生物活性。IFN-IFNAR相互作用激活JAK1和TYK2激酶以及轉錄因子STAT1和STAT2[32-33]。Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(The Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions ,JAK/STAT)信號通路和其他激酶和轉錄因子最終誘導IFN基因表達，保護機體免受病毒、細菌甚至真菌的感染[9,34-36]。Yang等[15]研究表明，犬IFN-ε能激活JAK/STAT信號通路，誘導干擾素誘導基因(ISGs)表達，發(fā)揮抗病毒作用[37]。本試驗結果為進一步研究該基因的結構和功能提供了理論依據(jù)。

4 結 論

本試驗克隆得到合作豬IFN-ε基因CDS序列，全長582bp。生物信息學分析表明，合作豬IFN-ε編碼193個氨基酸，CDS序列存在3個突變，均為錯義突變，其與瘤牛、蒙古野馬、綿羊、山羊等物種同源性較高。IFN-ε蛋白為堿性、親水、不穩(wěn)定型蛋白，二、三級結構預測顯示，該蛋白主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主。