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    右旋糖酐蔗糖酶純化及生產(chǎn)應(yīng)用的研究進(jìn)展

    2020-02-06 10:50:42徐欣東王清齊鵬翔黃雙霞梁欣泉
    中國調(diào)味品 2020年1期
    關(guān)鍵詞:右旋糖酐酶法分子量

    徐欣東,王清,齊鵬翔,黃雙霞,梁欣泉

    (1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院,南寧 530004;2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心,南寧 530004)

    在白砂糖的生產(chǎn)中,常常由于受到菌種感染而形成影響糖品質(zhì)量的“蔗飯”,其本質(zhì)是具有一定分子量的葡聚糖,又稱右旋糖酐(dextran)。充分利用右旋糖酐對糖品深加工及綜合利用具有實(shí)際產(chǎn)業(yè)意義,受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

    目前,右旋糖酐的酶法合成主要采用右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase)作為合成酶,其為GH70家族的一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶能夠以蔗糖為底物,在適宜的條件下聚合生成右旋糖酐[1]。此外,右旋糖酐蔗糖酶還可用于葡萄糖苷的合成,以及借助基因工程、雙酶聯(lián)用等技術(shù)實(shí)現(xiàn)低聚葡萄糖的合成。酶合成法相較目前工業(yè)上普遍采用的菌種發(fā)酵法,在產(chǎn)物分離純化、產(chǎn)物產(chǎn)率、連續(xù)生產(chǎn)等方面具有優(yōu)勢。因此,對右旋糖酐蔗糖酶的深入研究將有助于揭示酶的反應(yīng)機(jī)理,提升酶法合成的整體效率。文章綜述了右旋糖酐蔗糖酶的反應(yīng)機(jī)理、純化手段、生產(chǎn)改造及應(yīng)用等幾個(gè)方面的研究進(jìn)展,對右旋糖酐蔗糖酶與其他先進(jìn)技術(shù)的交叉應(yīng)用及未來發(fā)展進(jìn)行了闡述和展望。

    1 右旋糖酐蔗糖酶的反應(yīng)機(jī)理

    右旋糖酐蔗糖酶分子由1250~1600個(gè)氨基酸組成,其編碼基因大致可分為以下4個(gè)區(qū)域:A區(qū)域?yàn)樾盘栯亩危珺區(qū)域?yàn)闄C(jī)動(dòng)可變區(qū),C區(qū)域具有結(jié)合和切斷蔗糖中葡萄糖和果糖分子及轉(zhuǎn)移糖基的功能,D區(qū)域具有連接右旋糖酐鏈的功能。此外,有學(xué)者對右旋糖酐蔗糖酶的氨基酸序列進(jìn)行了定點(diǎn)突變,發(fā)現(xiàn)Asp-511和Asp-551的突變完全抑制了合成右旋糖酐和寡糖的活性,表明至少有兩個(gè)羧基對催化過程至關(guān)重要;然而酶結(jié)合右旋糖酐鏈的活性卻未因突變而喪失,表明右旋糖酐蔗糖酶具有與其他葡糖基轉(zhuǎn)移酶一樣的雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)[2]。右旋糖酐蔗糖酶的三維結(jié)構(gòu)圖見圖1。

    圖1 右旋糖酐蔗糖酶的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Three-dimensional structure drawing of dextransucrase

    一般認(rèn)為,右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖生成右旋糖酐和果糖的反應(yīng)可分為分離和連接兩個(gè)步驟[3],見圖2。因此其反應(yīng)機(jī)理可大致分為以下幾個(gè)過程:(1)葡萄糖基的分離,之后形成葡萄糖基-酶復(fù)合物,最后轉(zhuǎn)移到右旋糖酐主鏈或者支鏈上;(2)果糖釋放,這也是測定酶活力的重要依據(jù);(3)右旋糖酐鏈整條作為支鏈連接至另一條鏈上。對于右旋糖酐鏈聚合反應(yīng)終止的原因,可能是由右旋糖酐鏈與其他受體結(jié)合或者空間受限引起的。

    圖2 右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐的反應(yīng)機(jī)理Fig.2 The reaction mechanism of dextran synthesized by dextransucrase

    注:圖中○表示葡萄糖,△表示果糖,X1和X2表示右旋糖酐蔗糖酶的親核部分。

    2 右旋糖酐蔗糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及純化

    2.1 酶學(xué)性質(zhì)

    右旋糖酐蔗糖酶的分子量約為170 kDa,其pI值和米氏常數(shù)(Km)通常為4.1和12~16 mmol/L。該酶在純化后,其最適pH為5.0~5.5,最適溫度為30 ℃,其僅能通過分解蔗糖生成右旋糖酐,葡萄糖、蔗糖與葡萄糖的混合物以及其他自然糖都不能作為底物進(jìn)行生產(chǎn)[4]。在酶的激活方面, Ul-Qader等[5]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CaCl2的濃度為0.005%時(shí),酶活力提升至108.26 DSU/mL/h,與對照組相比提升了2.03倍;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)添加0.010% CaCl2時(shí),培養(yǎng)液內(nèi)的總蛋白含量較0.005%時(shí)高,但酶活力下降。由此可見,當(dāng)Ca2+在一定濃度范圍內(nèi)時(shí),Ca2+會(huì)優(yōu)先與酶上的激活位點(diǎn)結(jié)合,且激活作用強(qiáng)于抑制作用。

    2.2 純化方法

    從腸膜明串珠菌菌種中生產(chǎn)的右旋糖酐蔗糖酶為胞外酶,相比于其他具有相同作用的胞內(nèi)酶,該酶具有易分離和純化的優(yōu)勢。此外,右旋糖酐蔗糖酶屬于蛋白酶,可根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度、分子大小、帶電性質(zhì)、配體特異性等差異來進(jìn)行純化分離,因此在純化方法上主要有兩相分配法、物理過濾法、離子交換法、親和層析法等。

    2.2.1 兩相分配法

    兩相分配法利用兩相之間對待分離分子的溶解度差異來實(shí)現(xiàn)分離,其實(shí)質(zhì)是待分離分子在兩相間達(dá)到溶解平衡的過程。Nigam等[6]比較了聚乙二醇PEG6000與PEG400對右旋糖酐蔗糖酶的相分離純化效果,結(jié)果表明PEG6000的三級相分離效果更優(yōu),最終回收率為84%,且純化后的酶比活性及右旋糖酐產(chǎn)率均較高。Paul等[7]采用右旋糖酐和PEG之間的兩相分配法對右旋糖酐蔗糖酶進(jìn)行了純化,與凝膠過濾及超濾純化方法相比,兩相分配法的酶回收率為95%,比活性大于3500 DSU/mg,均優(yōu)于兩種過濾法。

    2.2.2 物理過濾法

    物理過濾法主要是通過蛋白質(zhì)分子大小差異來對酶進(jìn)行分離,其中常用的方法有透析法、超濾法、分子篩法(凝膠過濾法)等。Baruah等[8]采用基于PEG的離心透析純化法,該法以物理分離為主要思路,能較好地保留酶的原始性質(zhì)。Kaboli等[9]在對酶進(jìn)行固定化前采用超濾與凝膠過濾聯(lián)用的方法對游離右旋糖酐蔗糖酶進(jìn)行了純化,最后得到的酶回收率為54.2%,比活性則為34.3 U/mg。

    2.2.3 離子交換法

    由于蛋白質(zhì)帶有一定的電荷性質(zhì),因此可用電荷性質(zhì)相反的離子交換劑吸附蛋白質(zhì),隨后通過調(diào)節(jié)pH或離子強(qiáng)度的方式使其洗脫,以達(dá)到分離純化的效果。Ghai等[10]在用硫酸銨對粗酶液進(jìn)行分級沉淀后,將沉淀物溶解并用DEAE-纖維素陰離子交換層析對酶進(jìn)行純化,層析后得到3種右旋糖酐蔗糖酶異構(gòu)體,純化倍數(shù)分別為6.02,5.95,8.55。Guzman等[11]采用固定化酶法對酶進(jìn)行純化,首先將右旋糖酐蔗糖酶固定于右旋糖酐鏈上,經(jīng)過濾濃縮后再使用右旋糖酐酶對右旋糖酐-酶復(fù)合物進(jìn)行分解,最后用陰離子交換色譜法進(jìn)行分離,該法使用酶反應(yīng)產(chǎn)物作為載體來轉(zhuǎn)移目標(biāo)酶,為基于離子交換法提供了一種新的思路。

    2.2.4 親和層析法

    親和層析法是指利用與待分離蛋白質(zhì)分子具有特異可逆連接的配體來進(jìn)行分離純化的方法,具有較高的特異純化效果,也可對特定蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性識(shí)別。Miller等[12]使用基于離子交換、親和層析及與右旋糖酐酶聯(lián)用的方法來進(jìn)行純化,該法的純化效果較好,并發(fā)現(xiàn)存在兩種分子量的右旋糖酐蔗糖酶(177,158 kDa),同時(shí)研究了兩種酶在儲(chǔ)藏期間的含量變化關(guān)系,為酶純化后的儲(chǔ)存方法提供了參考。Moulis等[13]將右旋糖酐蔗糖酶中dsrS截短片段的重組蛋白與Ni-NTA樹脂進(jìn)行親和層析,產(chǎn)率為45%,所得的重組dsrS酶具有優(yōu)良的酶促專一性。

    3 右旋糖酐蔗糖酶的生產(chǎn)及改造

    3.1 生產(chǎn)優(yōu)化

    3.2 基因改造

    隨著近些年基因工程的快速發(fā)展,出現(xiàn)了采用異源表達(dá)法來進(jìn)行右旋糖酐蔗糖酶改造的研究,這對酶合成的糖苷鍵、酶活性、產(chǎn)物產(chǎn)率等指標(biāo)都有重要提升,是目前較為熱門的酶改造方法。李秋萍[17]從增強(qiáng)右旋糖酐蔗糖酶的轉(zhuǎn)糖基功能的角度入手,從分子層面對酶進(jìn)行改造,使突變后的DSR酶具有比原酶更高的轉(zhuǎn)糖基活性。Wang等[18]基于dsrYG基因構(gòu)建了誘變右旋糖酐蔗糖酶,突變酶所表達(dá)的右旋糖酐含有0%~52%的α(1,4)糖苷鍵,與原酶產(chǎn)物結(jié)構(gòu)有較大差異,該突變酶在合成超支化右旋糖酐方面存在較大潛力。Kang等[19]針對dsrE563基因進(jìn)行了截短表達(dá),其中發(fā)現(xiàn)GBD-CD2重組酶專門負(fù)責(zé)生成α(1,2)糖苷鍵,這從基因角度確定了右旋糖酐蔗糖酶上生成支鏈的活性位點(diǎn)。

    得益于基因工程的定點(diǎn)截短及突變能力,可對右旋糖酐蔗糖酶所合成糖苷鍵的類型、異源表達(dá)載體、轉(zhuǎn)糖基功能等方面進(jìn)行深入研究,這將有助于探索開發(fā)支化右旋糖酐等產(chǎn)物。

    4 右旋糖酐蔗糖酶的應(yīng)用

    4.1 合成右旋糖酐

    右旋糖酐(dextran)是一種由若干分子的葡萄糖經(jīng)過脫水連接形成的無毒無害的高聚均多糖,其在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。其中,高分子量右旋糖酐(Mw>106Da)可作為色譜柱填充劑;中分子量右旋糖酐(105Da

    目前工業(yè)生產(chǎn)右旋糖酐的主要方式為菌種發(fā)酵,但該法存在操作復(fù)雜、試劑消耗大等問題。酶法合成具有顯著的產(chǎn)物專一性,且右旋糖酐蔗糖酶具有底物特異性,因此該法在產(chǎn)物純度及提純難度上均優(yōu)于發(fā)酵法,減少了大量試劑的使用,具有一定的生產(chǎn)優(yōu)勢[22]。Kim等[23]對利用右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐作了相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜镏姓崽呛繛?%、溫度為25 ℃時(shí),產(chǎn)物中小分子量及高分子量右旋糖酐的占比較高。Goulas等[24,25]構(gòu)建了右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的雙酶體系,研究發(fā)現(xiàn)通過此法可調(diào)節(jié)右旋糖酐的分子量,且當(dāng)蔗糖濃度及右旋糖酐酶酶量增大時(shí),產(chǎn)物中低分子量右旋糖酐的產(chǎn)量會(huì)上升;此外,其還以雙酶體系為基礎(chǔ),制備了一個(gè)基于超濾膜技術(shù)的膜生物反應(yīng),在反應(yīng)體系中加入兩種酶,并將反應(yīng)液通過切割分子量為10 kDa的超濾膜,將酶進(jìn)行截留并回流至反應(yīng)體系中,而產(chǎn)物和果糖等單糖則透過膜進(jìn)行分離;該法在酶的循環(huán)利用和產(chǎn)物-酶分離上具有較好的優(yōu)勢,但還存在膜易堵塞、成本較高等問題。

    由此可見,目前右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶聯(lián)用法可以實(shí)現(xiàn)定向制備特定分子量右旋糖酐[26],基于此理論體系,可以再結(jié)合膜分離、固定化酶等技術(shù)對生產(chǎn)效率及實(shí)際可行性進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

    4.2 合成低聚葡萄糖

    低聚糖作為一種新型功能性多糖,廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,是一種具有良好研究前景的產(chǎn)品[27]。在酶法合成右旋糖酐中,產(chǎn)物分子量普遍在106Da以上,通過雙酶聯(lián)用法或融合酶法可有效降低產(chǎn)物分子量,以實(shí)現(xiàn)低聚葡萄糖的合成。Gan等[28]使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐分解酶協(xié)同催化的方法制得了分子量為6587 Da的低聚糖,并通過紅外光譜及核磁共振表征結(jié)果推論該低聚糖由35個(gè)α(1,6)糖苷鍵和1個(gè)由α(1,3)糖苷鍵連接的葡萄糖殘基組成,驗(yàn)證了雙酶法合成低聚葡萄糖的可行性。Hou等[29]設(shè)計(jì)了一種基于雙酶法的循環(huán)超濾膜生物反應(yīng)器,該裝置在0.8 mol/L蔗糖、30 h反應(yīng)時(shí)間的條件下,Mw<104Da的右旋糖酐占比為60.19%,為低聚葡萄糖的批量生產(chǎn)提供了參考。Kim等[30]將兩種酶進(jìn)行融合以應(yīng)用于低聚葡萄糖的生產(chǎn),實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)融合酶法生產(chǎn)低聚糖的產(chǎn)量是同活性下雙酶法的30倍。由此可見,低聚葡萄糖可通過工程酶法和雙酶法進(jìn)行合成,如能對低聚糖產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行表征,則可進(jìn)一步驗(yàn)證該工藝的生產(chǎn)意義。

    4.3 合成葡萄糖苷

    由于右旋糖酐蔗糖酶具有轉(zhuǎn)糖基功能,因此有學(xué)者以此酶為工具來對特定葡萄糖苷的合成進(jìn)行研究。Nam等[31]利用來自于腸膜明串珠菌的右旋糖酐蔗糖酶來酶促修飾咖啡酸,經(jīng)表征后確定合成產(chǎn)物為咖啡酸葡萄糖苷,其相較于咖啡酸,水溶性提升3倍,抗脂質(zhì)過氧化作用提升1.66倍,抗癌細(xì)胞生長作用提升15%,可作為食品或藥品的適宜成分。Seo等[32]采用右旋糖酐蔗糖酶酶促合成對苯二酚葡萄糖苷,其得到的產(chǎn)物的抗氧化性及亞硝酸鹽清除活性均高于β-熊果苷。由此可見,對于具有酚羥基及醇羥基的部分有機(jī)物,可通過右旋糖酐蔗糖酶的轉(zhuǎn)糖基功能來合成相應(yīng)的葡萄糖苷,而這種糖苷反應(yīng)對目前多種調(diào)味品成分的構(gòu)建具有重要指導(dǎo)意義[33,34]。

    5 總結(jié)與展望

    上述研究表明,通過右旋糖酐蔗糖酶催化反應(yīng)及酶基因改造,可以以蔗糖為原料合成具有更多應(yīng)用、更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的右旋糖酐、低聚糖、葡萄糖苷等產(chǎn)物,為蔗糖深加工提供了一條新的路線。從技術(shù)強(qiáng)化角度來看,已經(jīng)能夠?qū)⒂倚囚崽敲概c基因工程、膜技術(shù)等當(dāng)今熱門研究技術(shù)相結(jié)合,增強(qiáng)或改變右旋糖酐蔗糖酶的特定功能,從而開發(fā)出融合酶、酶膜反應(yīng)器等新產(chǎn)品,進(jìn)而以此為工具生產(chǎn)更多的高值化物質(zhì)。

    在右旋糖酐蔗糖酶所引發(fā)的糖苷化反應(yīng)方面,目前還缺少糖苷化反應(yīng)中酶對底物特異性識(shí)別的相關(guān)機(jī)理研究,如能對該方面進(jìn)行進(jìn)一步研究,就可從聚合角度對右旋糖酐的改性有更深入的了解,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)利用改性單體進(jìn)行糖苷化聚合形成改性右旋糖酐,以擴(kuò)展右旋糖酐蔗糖酶的應(yīng)用潛力。

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