響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲調(diào)味酒的發(fā)酵條件

董彩文，王雪純，李一晴，汪雪蓮，楊曉磊，胡曉龍*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；3.長葛市頤恒健蜂業(yè)有限公司，河南 長葛 461502；4.許昌市蜂蜜發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 長葛 461502)

紅曲米是曲霉科真菌屬紅曲霉的菌絲體附著寄生在糯米中，并且以秈稻和粳稻等為原料發(fā)酵而成，紅曲米具有許多十分重要的藥用功能，例如：降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗癌等多種重要功效[1,2]。紅曲調(diào)味酒以蜂蜜為原料，將蜂蜜的營養(yǎng)功能和酒的保健功能集為一體，所以對其進(jìn)行開發(fā)更具有特色和一定的商業(yè)價(jià)值[3]。紅曲已經(jīng)在調(diào)味品中得到應(yīng)用[4]，同時(shí)已經(jīng)建立了紅曲釀造料酒的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究的紅曲調(diào)味酒則是在蜂蜜發(fā)酵的基礎(chǔ)上，在釀酒的過程中利用紅曲米和酵母進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，紅曲米中的多種活性物質(zhì)溶解于酒中，可以加強(qiáng)營養(yǎng)保健功能[6]；同時(shí)，與傳統(tǒng)的料酒工藝相比[7]，省去了浸米、蒸米、淋飯等復(fù)雜操作，更容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化和連續(xù)化生產(chǎn)。高級醇是酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其含量高低對調(diào)味酒的香氣和品質(zhì)有很大影響，是評價(jià)酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[8]。

通過單因素試驗(yàn)確定pH、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、氮源、糖濃度等對紅曲調(diào)味酒中高級醇含量的影響；然后通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定釀造紅曲調(diào)味酒的最佳條件[9,10]。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜：棗花蜜，購自長葛市；紅曲米：購自福建古田；釀酒高活性酵母：購自安琪公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

蜂蜜→稀釋→調(diào)酸→加熱滅菌→冷卻→接入酵母(加磷酸氫二銨)→發(fā)酵→分離原酒→調(diào)整成分→過濾→裝瓶→滅菌→冷卻→成品。

1.2.2 高級醇的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6支干凈的比色管，編號依次為0～5。在6支比色管中依次分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL高級醇標(biāo)準(zhǔn)使用液，加水定容至2.0 mL，搖勻后置于冰水浴中，沿管壁緩慢加入4 mL 0.5%對二氨基苯甲醛濃硫酸溶液，將各比色管同時(shí)搖勻后蓋塞，置于沸水浴中精確計(jì)時(shí)加熱15 min后取出迅速放于冰水中冷卻，加水定容至10 mL搖勻后，用1 mL比色皿以0號管作為對照，于520 nm波長下測定OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，高級醇含量為橫坐標(biāo)，繪制高級醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 發(fā)酵液中高級醇的測定

在空白對照組中加入2 mL蒸餾水，其余試驗(yàn)組中加入1.5 mL蒸餾水、0.5 mL樣液。在冰水浴中加入0.5%對二氨基苯甲醛濃硫酸溶液4 mL，隨后放入80 ℃的水浴中15 min。取出后加入4 mL的蒸餾水混勻，用分光光度計(jì)測量OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算高級醇含量。

1.2.3 紅曲調(diào)味酒發(fā)酵溫度試驗(yàn)

配制的蜂蜜水糖度為16%，pH調(diào)整為4.5，紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g。將溫度梯度設(shè)置為24，26，28，30，32 ℃，每個(gè)溫度包含2瓶樣品作為平行試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為3 d。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級醇的測定。

1.2.4 紅曲調(diào)味酒發(fā)酵pH試驗(yàn)

配制的蜂蜜水糖度為16%，培養(yǎng)溫度為28 ℃，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g。將pH梯度設(shè)置為3.5，4，4.5，5，5.5，每個(gè)pH包含2瓶樣品作為平行試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為3 d。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級醇的測定。

1.2.5 紅曲調(diào)味酒發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)

配制的蜂蜜水糖度為22%，pH調(diào)整為4.5，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g，將培養(yǎng)時(shí)間梯度設(shè)置為3，4，5，6，7 d，每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間梯度下包含2瓶樣品作為平行試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級醇的測定。

1.2.6 紅曲調(diào)味酒發(fā)酵氮源添加量試驗(yàn)

配制的蜂蜜水糖度為22%，pH調(diào)整為4.5，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g，發(fā)酵時(shí)間為5 d。將氮源添加量梯度設(shè)置為300，600，900，1200，1500 mg/L，每個(gè)氮源添加量梯度下包含2瓶樣品作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級醇的測定。

1.2.7 紅曲調(diào)味酒發(fā)酵糖濃度試驗(yàn)

配制的蜂蜜水pH為4.5，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g，磷酸氫二銨添加量為900 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間為5 d。將糖濃度梯度設(shè)置為16%、20%、24%、28%、32%，每個(gè)糖濃度梯度下包含2瓶樣品作為平行試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液蒸餾，進(jìn)行高級醇的測定。

1.2.8 方差分析軟件分析單變量單因素的顯著性

采用方差分析方法對由各個(gè)因素得到的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。分析得到的結(jié)果中，顯著的兩個(gè)單變量之間用不同的字母表示,不顯著的兩個(gè)單變量之間用相同的字母表示。

1.2.9 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對紅曲調(diào)味酒發(fā)酵影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 高級醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照高級醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 高級醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of higher alcohols

由圖1可知，R2值達(dá)到0.99，說明擬合的試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確率較高。通過該回歸曲線得到的高級醇含量結(jié)果較為準(zhǔn)確。

2.2 發(fā)酵溫度對紅曲調(diào)味酒高級醇的影響結(jié)果

圖2 溫度對高級醇的影響Fig.2 Effect of temperature on higher alcohols

由圖2可知，高級醇的含量先呈現(xiàn)下降的趨勢，在28 ℃時(shí)達(dá)到最低值，隨后高級醇的含量又有緩慢的回升，但是差別不顯著。

2.3 pH對紅曲調(diào)味酒高級醇的影響結(jié)果

圖3 pH對高級醇的影響Fig.3 Effect of pH on higher alcohols

由圖3可知，高級醇含量隨著pH的上升先上升后下降，在pH達(dá)到5以后，高級醇含量趨于平衡。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對紅曲調(diào)味酒高級醇的影響結(jié)果

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對高級醇的影響Fig.4 Effect of culture time on higher alcohols

由圖4可知，高級醇含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，超過5 d以后增加明顯。

2.5 氮源添加量對紅曲調(diào)味酒高級醇的影響結(jié)果

圖5 氮源添加量對高級醇的影響Fig.5 Effect of nitrogen source additive amount on higher alcohols

由圖5可知，磷酸氫二銨濃度的變化對高級醇的生成影響不明顯。方差分析結(jié)果顯示：磷酸氫二銨濃度為300，600，900，1200 mg/L 時(shí)，4個(gè)試驗(yàn)組無顯著性差異。說明在此范圍內(nèi)，磷酸氫二銨濃度對高級醇的生成影響不大。當(dāng)磷酸氫二銨濃度達(dá)到1500 mg/L時(shí)，高級醇的生成顯著降低。

2.6 糖濃度對紅曲調(diào)味酒高級醇的影響結(jié)果

圖6 糖濃度對高級醇的影響Fig.6 Effect of sugar concentration on higher alcohols

由圖6可知，糖濃度為16%時(shí)，高級醇含量達(dá)到最高值。隨著糖濃度增加，高級醇含量減少。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

其中高級醇的回歸方程為：

Y=43.16+0.44A-1.6B-26.49C+7.1AB-2.17AC-6.7BC+10.66A2+1.43B2+20.51C2，方程中每項(xiàng)字母前系數(shù)的正負(fù)代表Y值的影響是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 高級醇回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of higher alcohols regression equations

注：“****”為差異極顯著(P<0.0001)；“***”為差異高度顯著(P<0.01)；“**”為差異顯著(P<0.05)；“*”為差異不顯著(P>0.05)。

由表3可知，由于模型的P值<0.01，說明該模型高度顯著?；貧w方程的回歸系數(shù)>0.9049，說明約有90.49%高級醇含量的變化率可以用該模型來解釋。對糖度、磷酸氫二銨添加量和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間的P值<0.0001，說明培養(yǎng)時(shí)間對高級醇的影響是極顯著的。糖度的P值=0.8654>0.05，說明糖度對高級醇變化率的影響是不顯著的。磷酸氫二銨的P值=0.5405>0.05，說明磷酸氫二銨對高級醇變化率的影響是不顯著的。但是該模型總體對高級醇變化率的影響是高度顯著的。在對二次項(xiàng)的分析中，發(fā)現(xiàn)糖濃度的P值=0.0171<0.05，磷酸氫二銨添加量的P值=0.6886>0.05，培養(yǎng)時(shí)間的P值=0.0006<0.01，分別說明糖濃度對高級醇變化率的影響是顯著的，磷酸氫二銨添加量對高級醇變化率的影響是不顯著的，培養(yǎng)時(shí)間對高級醇變化率的影響是高度顯著的。在交互項(xiàng)中，AB、AC、BC的P值均大于0.05，說明交互項(xiàng)對高級醇變化率的影響是不顯著的。綜合以上分析表明，回歸方程為高級醇的變化率提供了一個(gè)較為合適的模型。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

軟件分析給出的試驗(yàn)條件及結(jié)果為：當(dāng)糖濃度為25.45%、磷酸氫二銨添加量為1000 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為6 d時(shí)理論的高級醇含量為28.78 mg/L。為了驗(yàn)證該模型給出的方案是否與實(shí)際情況相符合，進(jìn)行2次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，但是從實(shí)際情況考慮，高級醇的驗(yàn)證條件調(diào)整為：糖度為25.4%，磷酸氫二銨添加量為1000 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間為6 d。高級醇的驗(yàn)證試驗(yàn)中實(shí)際測得的高級醇平均值為28.6 mg/L，與理論值的相對誤差為0.6%，說明該模型能較好地反映實(shí)際情況。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法考察了培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間、氮源添加量、糖濃度等因素對高級醇含量的影響。結(jié)果表明：培養(yǎng)時(shí)間對紅曲調(diào)味酒釀造過程的影響較大，其次是糖濃度的影響。通過響應(yīng)面優(yōu)化和驗(yàn)證試驗(yàn)得到的高級醇的優(yōu)化方案為：培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)液pH為5，紅曲米添加量為4%，酵母添加量為0.2%，糖濃度為25.4%，磷酸氫二銨添加量為1000 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間為6 d。